[发明专利]一种高纯度水黄皮素的制备方法

摘要

本发明涉及一种高纯度水黄皮素的制备方法，其方法是将干花豆的干燥根粉碎，用乙醇加热回流提取，合并提取液，浓缩，混悬液用石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物。石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚乙酸乙酯丙酮系统梯度洗脱，用薄层色谱检测，收集含有水黄皮素的洗脱液，合并，减压浓缩，重结晶，得到水黄皮素粗结晶。再用制备高效液相法分离纯化，对所收集的每一份洗脱液利用分析型高效液相色谱检测，分别得到纯度在90%～98%之间的水黄皮素和纯度大于98%的水黄皮素组分。该设计合理，工艺简单分离速度快，生产周期短，适合工业化生产。

主权项

一种高纯度水黄皮素的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：1)干豆花的干燥根6kg粉碎后用10倍重量的70％的乙醇回流提取5次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；2)浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物；3)石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄皮素的流分，所述的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱条件为：0‑15min，洗脱系统为石油醚；16‑60min，洗脱系统为石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，比例为9：1：1；4)流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的水黄皮素粗结晶；5)将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分；6)对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90％‑98％之间和纯度大于98％以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为96.6％以及99.3％的水黄皮素；所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C‑18柱，甲醇‑水：75:25为流动相洗脱，流速为5mL/min，检测波长为304nm，柱温为35℃；所述步骤4)TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅胶G薄层板上，分别按20ug、40ug、60ug、80ug、100ug不同的浓度梯度点样，以重量比例为7：3的石油醚‑丙酮、重量比例为9.8:0.2二氯甲烷‑丙酮、重量比例为8:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光下检视；在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C‑18，4.6×250mm，10um；流速：1ml/min；进样量：10ul；系统条件：流动相乙腈‑0.2％磷酸80：20，检测波长304nm；面积归一化法计算含量，水黄皮素峰不得少于98.0％；或所述方法具体包括如下步骤：1)干豆花的干燥根5kg粉碎后用7倍重量的60％的乙醇回流提取2次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；2)浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物；3)石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄皮素的流分，所述的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱条件为：0‑10min，洗脱系统为石油醚；11‑50min，洗脱系统为石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，比例为6：4：1；4)流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的水黄皮素粗结晶；5)将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分；6)对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90％‑98％之间和纯度大于98％以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为96.5％以及99.2％的水黄皮素；所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C‑18柱，甲醇‑水：15:85为流动相洗脱，流速为10mL/min，检测波长为304nm，柱温为35℃；所述步骤4)TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅胶G薄层板上，分别按20ug、40ug、60ug、80ug、100ug不同的浓度梯度点样，以重量比例为7：3的石油醚‑丙酮、重量比例为9.8:0.2的二氯甲烷‑丙酮、重量比例为8:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光下检视； 在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C‑18，4.6×250mm，10um；流速：0.8ml/min；进样量：10ul；系统条件：甲醇‑0.2％磷酸溶液30:70，检测波长260nm；面积归一化法计算含量，水黄皮素峰不得少于98.0％；或所述方法具体包括如下步骤：1)干豆花的干燥根5kg粉碎后用6倍重量的50％的乙醇回流提取8次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；2)浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物；3)石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄皮素的流分，所述的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱条件为：0‑20min，洗脱系统为石油醚；21‑50min，洗脱系统为石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，比例为8：1：2；4)流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的水黄皮素粗结晶；5)将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分；6)对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90％‑98％之间和纯度大于98％以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为95.2％以及99.0％的水黄皮素；所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C‑18柱，甲醇‑水：30:70为流动相洗脱，流速为8mL/min，检测波长为304nm，柱温为30℃；所述步骤4)TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅胶G薄层板上，分别按20ug、40ug、60ug、80ug、100ug不同的浓度梯度点样，以重量比例为7：3的石油醚‑丙酮、重量比例为9.8:0.2二氯甲烷‑丙酮、重量比例为8:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光下检视。在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C‑18，4.6×250mm，10um；流速：1ml/min；进样量：20ul；系统条件：甲醇‑0.2％磷酸溶液90:10，检测波长260nm；面积归一化法计算含量，水黄皮素峰不得少于98.0％；或所述方法具体包括如下步骤：1)干豆花的干燥根5kg粉碎后用5倍重量的60％的乙醇回流提取7次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；2)浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物；3)石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄皮素的流分，所述的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱条件为：梯度洗脱条件为：0‑15min，洗脱系统为石油醚；16‑50min，洗脱系统为石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，比例为9：3：1；4)流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的水黄皮素粗结晶；5)将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分；6)对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90％‑98％之间和纯度大于98％以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度为94.3％以及99.1％的水黄皮素；所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C‑18柱，甲醇‑水：40:60为流动相洗脱，流速为6mL/min，检测波长为304nm，柱温为30℃；所述步骤4)TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅胶G薄层板上，分别按20ug、40ug、60ug、80ug、100ug不同的浓度梯度点样，以重量比例为7：3的石油醚‑丙酮、重量比例为9.8:0.2二氯甲烷‑丙酮、重量比例为8:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光下检视； 在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C‑18，4.6×250mm，10um；流速：1ml/min；进样量：20ul；系统条件：乙腈‑0.2％磷酸溶液30:70，检测波长260nm；面积归一化法计算含量，水黄皮素峰不得少于98.0％；或所述方法具体包括如下步骤：1)干豆花的干燥根5kg粉碎后用10倍重量的65％的乙醇回流提取3次，提取液滤过，合并滤液，回收乙醇，得浸膏；2)浸膏再经石油醚萃取，静置，合并石油醚层，浓缩得石油醚萃取物；3)石油醚萃取物经硅胶柱层析，用石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱，收集含水黄皮素的流分，所述的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮系统梯度洗脱条件为：0‑25min，洗脱系统为石油醚；26‑70min，洗脱系统为石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，比例为7：2：1；4)流分用TLC检测合并，浓缩，重结晶，即得纯度为重量含量80～90％的水黄皮素粗结晶；5)将水黄皮素粗结晶用制备高效液相色谱法分离纯化，收集水黄皮素组分；6)对所收集的每一份洗脱液利用HPLC检测，合并保留时间相同而且纯度在90％‑98％之间和纯度大于98％以上的水黄皮素，减压浓缩，得到纯度92.3％以及99.7％的水黄皮素；所述步骤5)制备高效液相色谱的色谱柱为C‑18柱，甲醇‑水：75:25为流动相洗脱，流速为7mL/min，检测波长为304nm，柱温为30℃；所述步骤4)TLC检测方法为：取水黄皮素粗品加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，在同一硅胶G薄层板上，分别按20ug、40ug、60ug、80ug、100ug不同的浓度梯度点样，以重量比例为7：3的石油醚‑丙酮、重量比例为9.8:0.2二氯甲烷‑丙酮、重量比例为8:1:1的石油醚‑乙酸乙酯‑丙酮，三种系统为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置365nm紫外光下检视； 在薄层色谱中，三种展开剂系统，五个不同浓度的梯度点样，均为单一斑点，未见杂质斑点；所述步骤6)的HPLC检测方法为：色谱条件：色谱柱C‑18，4.6×250mm，10um；流速：1ml/min；进样量：10ul；系统条件：乙腈‑0.2％磷酸溶液30:70，检测波长304nm；面积归一化法计算含量，水黄皮素峰不得少于98.0％。