[发明专利]一种删除转基因水稻筛选标记基因的方法

摘要

本发明提供了一种删除转基因水稻标记基因的方法，属于植物基因工程领域。本发明利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术建立了一个在植株水平上高效率删除转基因水稻标记基因的方法。利用本发明的方法可以有效地删除整段标记基因，并且能够针对性地只删除标记基因的表达框，而不改变转基因水稻中其他成分的表达。因此利用本发明的方法可以高效率培育无筛选标记基因的转基因水稻，从而能完全消除人们对筛选标记基因的安全性疑虑。

主权项

1.一种建立无筛选标记基因的水稻转基因体系的方法，其特征在于：所述方法利用CRISPR/Cas9系统介导的基因组定点编辑技术，建立无筛选标记基因的水稻转基因体系，所述方法包括以下步骤：1)在水稻筛选标记基因所转入的原载体中标记基因编码框上游序列区选取第一靶标片段，并且在标记基因编码框下游序列选取第二靶标片段，所述第一和第二靶标片段的一条链均具有5’‑(N)X‑NGG‑3’结构，其中(N)X表示数目为X的一条碱基序列{N1，N2……NX}，N1，N2……NX中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中N为碱基A、G、C、T中的任意一个，；2)分别合成OsU3启动子，第一靶标片段、SgRNA的编码框、OsU6启动子、第二靶标片段、SgRNA的编码框并在该合成片段上载有BsaI酶切位点，从而构建打靶载体质粒，用限制性内切酶BsaI对打靶载体质粒进行酶切，将合成片段和打靶载体质粒的大片段进行连接，并利用抗性培养基筛选所构建的载体；3)制备含有所述筛选标记基因的转基因水稻的愈伤组织，备用；4)将步骤2)所获得的重组载体导入步骤3)中获得的愈伤组织中的水稻细胞，诱导所述第一和第二靶标片段的向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框在水稻细胞中共同表达，对待删除的筛选标记基因编码框启动子上游及终止子下游的区域实现同时剪切，造成双链断裂，同时触发水稻细胞自身的DNA修复功能，在靶标位点造成缺失碱基，实现细胞内筛选标记基因、上游启动子及下游终止子的片段缺失；5)通过原生质体瞬时转化或农杆菌介导的稳定转化获得再生植株，通过基因组PCR方法克隆再生植株中含靶标片段的DNA区段，并对扩增产物测序；6)选择筛选标记基因编码框完全缺失的转基因植株，其中，OsU3启动子的序列为:AAGGGATCTTTAAACATACGAACAGATCACTTAAAGTTCTTCTGAAGCAACTTAAAGTTATCAGGCATGCATGGATCTTGGAGGAATCAGATGTGCAGTCAGGGACCATAGCACAAGACAGGCGTCTTCTACTGGTGCTACCAGCAAATGCTGGAAGCCGGGAACACTGGGTACGTTGGAAACCACGTGATGTGAAGAAGTAAGATAAACTGTAGGAGAAAAGCATTTCGTAGTGGGCCATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAOsU6启动子的序列为:GGATCATGAACCAACGGCCTGGCTGTATTTGGTGGTTGTGTAGGGAGATGGGGAGAAGAAAAGCCCGATTCTCTTCGCTGTGATGGGCTGGATGCATGCGGGGGAGCGGGAGGCCCAAGTACGTGCACGGTGAGCGGCCCACAGGGCGAGTGTGAGCGCGAGAGGCGGGAGGAACAGTTTAGTACCACATTGCCCAGCTAACTCGAACGCGACCAACTTATAAACCCGCGCGCTGTCGCTTGTGTGSgRNA的序列为:gttttagagctatgctgaaaagcatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttttagtagtagcatctgacggtgaagggggcggccgcgg。