[发明专利]玉米非生物胁迫响应因子ZmERF1基因启动子序列及其应用

摘要

本发明ZmERF1基因启动子序列除具有植物启动子的典型特征外，还含有乙烯响应相关的元件2个、ABA激素应答ABRE元件1个、脱水相关MYB1AT元件4个、MYCATERD元件1个、MYCATRD元件1个、低温抗寒调控元件18个、CBFHV元件8个、伤害调控WBOXNTERF元件9个、热休克CCAATBOX元件1个、组织特异性表达调控CAATBOX元件27个、种子发育相关EBOXBNNAPA元件18个、淀粉酶相关AMYBOX2元件1个、CGACGOSAMY元件1个、糖相关WBOXHVISO元件5个、调控根毛发育相关RHERPATEXPA元件2个；该基因启动子对调控玉米发育和抗逆性具有应用价值。

主权项

玉米非生物胁迫响应因子ZmERF1基因启动子，其特征在于：响应因子ZmERF1基因启动子全长序列2217bp：ATTTAAGCTT GAAGTTGATG GCATCAATCT GCCAGTCTGA TTTTCAGACC TATCCAACCT GACAGCCTGA CTTTAGGCAT GATTATCTCT AAATTTTTCA CAAGAACATG GCTTGCACTC TTAAGCAAAT TTGTTATCCA TTGATTGCTC TACAATTTTG ATGTGGTGAC TTAGGGCAAA AACCCTATGC TTTACAAGTT ACAAAGCCCT AAAGTGGAGC CTTTAACACT GAATTTCAGA CTTAGTGTAG AACTCAAATG AGGTCCATTT TGCATTTAAG TCCAAAACTT AGGGTTTGGC TTTCAAGTCC ACATATTTGT GAACCAAAGG ACTTAAAATA CTTATTTGGC TTGGTTTTTG CACTTTAGTC CAAAAGTGGA CCAATTTTGC ATATAAACCC CTAGGGTTTG GTTTCAGGGT TTTCCAGGGT TTTAATTAGG GTTTCTGGTA TCCCAGGGGT ACAAAAGTGA TTCAAGTTTA TTCTTAGGGT CATTTTATGA CTTTTACCCT AAAGCTTTTA GATTTTCTCA ACTTGGGTTA AGTTTTACCC CTTTAACCAC TATTTAGGGT TAAGTCCTTT AACCAGGGTT CTTTTTGCAA AACAACACAA CTTGTTTGAA ATTTTTGCCT AGTGAATGCA CTCTAGGTGT GTCAAACATA TGCAATGCCA ATGCTATGAT GCCATGCTCA AGTTTTAGTT ACAGTAACAC CAGGGGTGTT ACAATTGCTG TGGATGACGC TCAAATCCAT TGGGTCGTCT AGGCTTGAGT TGATCCAATC CTGCGTCGAT CCACTTCGCT AGACGTTCCT CCCCAGGCCC ACAAAGGGAT GACCTTGCGA AATATTGGGC CCAAAGCCTT TCGCGAGGTC TTCTAACCTT CCAGTGGACC TGGGGGATAT CTGTCCCCCA CACATTATGC CCGAAGGGAG ATAATGCTTC GAAGGACAAA GGTCTTTAAC ACTTAAGAAT TTTGTTGCGT TGTTTCATGA TTAAGTAATA AAAACAAGAG ATCAACACTA TGCTCTTTTC TTAATCGATC ATTCTAAAAA GTACATGATT TTTGTCGACT TTACACCCAC TCAAAATTGG TGTAAGCACA TGCCATACAA GAGGTTCATA GAAACGATTA TCATGGCCTT AAAGAAATAT AAGATTGTCT ACAGCATGAA ACGTTCTAGA TGGGTGGTGG ATATTTTTAA ATTGGAAAAT AAAATTCAGA CTGATGCTTC AATTGACATA AAATGATATT TTCTCCGTGC CACCTTCTCA GCAATTTAAT TTTTTCTATG ATTTCCATTA CATATAACAT AGTTGGCAAA ACATTATTAT GAAGGATTAA CACCAGCTAC CTCGTTCTAC AAGCTATGTC CATGGGGGTA ATAACAGGCG AATGGAATTT GTTAGGGGTG AGTGGAGTAC GCATGTTTCA CGTTCAAGTA TACATTAATA AAAACATTGG TATTTTGTTC ACTTATGTCT TTGTGTGTAG GATGTATATA TTCTTCCAAG AAACTTTATG ATCGATCTGT TAATTTATGA GGACAATTCG TGCCGATATG TCATCCCTCC AAACATACAG CATAGACTTA TCAATATCGC TAAAGAGGAT TAAATTAGTGACGGTTGTCG ACATATTCGT CTATCATTAA AAATTCTATA TTGACTATTT AGAAATAATTTGTATGATA TTGATAATGT TCGATATTAT TTCAATCTAT TTTAGTCAGC GTATTTATAATAATTATATA TTTATATCAT CAATATAATA TTATTGTTAT GATAATATTT TATAGTACGAATTTTATATA TTATGAAATA TCGTTTCATA TATATGTTTT ATATTAATTT TTCTAATTTACTTAAGCATC TGACGCTAAG TGTCCTGTGC CCGGATCGGC CAGAGCGGTC AAATGGTTCA ATGCTTTACC TCCTCTGGTT GGTGTCCAGC TTGGGGGCAG CTGCCTTTCA TTTCCATTCT TCCAGTTGCA CCCAGACCCA GGCAGGTCAT CGGCGCCCAC AACTCCAAGT TGTATAAATA CTCCGTCGAC CGTCTCATAA CAGTCATACC GCCGAACCAA ATCCAACGTC CACAGAAAAG AAAACACATT CCCGTCGACT CCCCTAGTTT CATCCTATTC ATTTCTCCCC CCAAACACTC CAGCTACTAG TTACTCGAGG AATCCATGTG CGGCGGCGCA ATCATCTTCG ACTACAT；玉米自交系N04 ZmERF1基因启动子的克隆及序列分析如下：a. 玉米自交系N04 DNA的提取取0.5 g幼嫩叶片置于研钵中，加入液氮后研磨成粉末，将粉末迅速装入2.0 mL的离心管中，加入800 μL质量分数1% SLS提取液，加入800 μL 按照比例为25：24：1的苯酚、氯仿与异戊醇组成的混合液，充分混匀，65℃温育30 min，冷却至室温后，12000 rpm离心10 min，吸取上清液转至另一干净的1.5 mL离心管中，加入0.6倍上清液体积的预冷异丙醇混匀，12000 rpm离心10 min，弃上清液，用75%乙醇漂洗，漂洗后短暂离心，留DNA于管底进行干燥，DNA干燥后用灭菌水溶解，置于‑20℃冷藏备用；其中质量分数1% SLS提取液是将100 mmol.L‑1 Tris‑HCl、100 mmol.L‑1 NaCl、20 mmol.L‑1 EDTA和10 g.L‑1 SLS混匀，然后调节PH=8.0后获得的混合液；b. ZmERF1基因启动子的克隆根据玉米自交系N04 ZmERF1基因的启动子序列，设计了两对特异性引物，这两对引物扩增的片段相重叠，特异性引物序列I为：F1391：5'GCGGATCCATTTAAGCTTGAAGTTGATGGC3'和R1391：5'TATTACCCCCATGGACATAGCT3'；特异性引物序列II：F865：5'AAGCTATGTCCATGGGGGTAAT3'和R865：5'GCAGATCTATGTAGTCGAAGATGATTGCGC3'；以玉米自交系N04的DNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系为：5 μL Hifi Buffer (10×)，2 μL 2.5 mol.L‑1 dNTP，1 μL Primer‑F (R)，1 μL Taq DNA Polymerase，1 μL 模板DNA，ddH2O补足50 μL；PCR体系扩增程序为：95℃预变性4 min，95℃变性45 sec，60℃退火45 sec，72℃延伸60 sec，共循环34次；72℃延伸10min，10℃ forever；扩增产物用质量分数1%琼脂糖凝胶电泳检测，用回收试剂盒回收，并且连接到PMD18‑T载体上，进行测序；测序的启动子序列为：PMD18‑1391：GCGGATCCAT TTAAGCTTGA AGTTGATGGC ATCAATCTGC CAGTCTGATT TTCAGACCTA TCCAACCTGA CAGCCTGACT TTAGGCATGA TTATCTCTAA ATTTTTCACA AGAACATGGC TTGCACTCTT AAGCAAATTT GTTATCCATT GATTGCTCTA CAATTTTGAT GTGGTGACTT AGGGCAAAAA CCCTATGCTT TACAAGTTAC AAAGCCCTAA AGTGGAGCCT TTAACACTGA ATTTCAGACT TAGTGTAGAA CTCAAATGAG GTCCATTTTG CATTTAAGTC CAAAACTTAG GGTTTGGCTT TCAAGTCCAC ATATTTGTGA ACCAAAGGAC TTAAAATACT TATTTGGCTT GGTTTTTGCA CCTTAGTCCA AAAGTGGACC AATTTTGCAT ATAAACCCCT AGGGTTTGGT TTCAGGGTTT TCCAGGGTTT TAATTAGGGT TTCTGGTATC CCAGGGGTAC AAAAGTGATT CAAGTTTATT CTTAGGGTCA TTTTATGACT TTTACCCTAA AGCTTTTAGA TTTTCTCAAC TTGGGTTAAG TTTTACCCCT TTAACCACTA TTTAGGGTTA AGTCCTTTAA CCAGGGTTCT TTTTGCAAAA CAACACAACT TGTTTGAAAT TTTTGCCTTG TGAATGCACT CTAGGTGTGT CAAACATATG CAATGCCAAT GCTATGATGC CATGCTCAAG TTTTAGTTAC AGTAACACCA GGGGTGTTAC AATTGCTGTG GATGACGCTC AAATCCATTG GGTCGTCTGG GCTTGAGTTG ATCCAATCCT GCGTCGATCC ACTTCGCTAG ACGTTCCTCC CCAGGCCCAC AAAGGGATGA CCTTGCGAAA TATTGGGCCC AAAGCCTTTC GCGAGGTCTT CTAACCTTCC AGTGGACCTG GGGGATATCT GTCCCCCACA CATTATGCCC GAAGGGAGAT AATGCTTCGA AGGACAAAGG TCTTTAACAC TTAAGAATTT TGTTGCGTTG TTTCATGATT AAGTAATAAA AACAAGAGAT CAACACTATG CTCTTTTCTT AATCGATCAT TCTAAAAAGT ACATGATTTT TGTCGACTTT ACACCCACTC AAAATTGGTG TAAGCACATG CCATACAAGA GGTTCATAGA AACGATTATC ATGGCCTTAA AGAAATATAA GATTGTCTAC AGCATGAAAC GTTCTAGATG GGTGGTGGAT ATTTTTAAAT TGGAAAATAA AATTCAGACT GATGCTTCAA TTGACATAAA ATGATATTTTCTCCGTGCCA CCTTCTCAGC AATTTAATTT TTTCTATGAT TTCCATTACA TATAACATAGTTGGCAAAAC ATTATTATGA AGGATTAACA CCAGCTACCT CGTTCTACAA GCTATGTCCA TGGGGGTAAT APMD18‑865：AAGCTATGTC CATGGGGGTA ATAACAGGCG AATGGAATTT GTTAGGGGTG AGTGGAGTAC GCATGTTTCA CGTTCAAGTA TACATTAATA AAAACATTGG TATTTTGTTC ACTTATGTCT TTGTGTGTAG GATGTATATA TTCTTCCAAG AAACTTTATG ATCGATCTGT TAATTTATGA GGACAATTCG TGCCGATATG TCATCCCTCC AAACATACAG CATAGACTTA TCAATATCGC TAAAGAGGAT TAAATTAGTG TACGGTTGTC GACATATTCG TCTATCATTA AAAATTCTAT ATTGACTATT TAGAAATAAT TTGTATGATA TTGATAATGT TCGATATTAT TTCAATCTAT TTTAGTCAGC GTATTTATAA TAATTATATA TTTATATCAT CAATATAATA TTATTGTTAT GATAATATTT TATAGTACGA ATTTTATATA TTATGAAATA TCGTTTCATA TATATGTTTT ATATTAATTT TTCTAATTTA CTTAAGCATC TGACGCTAAG TGTCCTGTGC CCGGATCGGC CAGAGCGGTC AAATGGTTCA ATGCTTTACC TCCTCTGGTT GGTGTCCAGC TTGGGGGCAG CTGCCTTTCA TTTCCATTCT TCCAGTTGCA CCCAGACCCA GGCAGGTCAT CGGCGCCCAC AACTCCAAGT TGTATAAATA CTCCGTCGAC CGTCTCATAA CAGTCATACC GCCGAACCAA ATCCAACGTC CACAGAAAAG AAAACACATT CCCGTCGACT CCCCTAGTTT CATCCTATTC ATTTCTCCCC CCAAACACTC CAGCTACTAG TTACTCGAGG AATCCATGTG CGGCGGCGCA ATCATCTTCG ACTACATAGA TCTCG；c. 转化载体的构建用BamHI和NcoI双酶切连接在T载体上的1391 bp启动子序列，同时用BamHI和NcoI双酶切pCAMBIA1301载体；回收后将pCAMBIA1301载体与1391 bp启动子序列连接；然后转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆摇菌，PCR检测正确的单克隆提取质粒，酶切鉴定；鉴定正确携带有1391 bp启动子序列的pCAMBIA1301载体再用NcoI和BglII双酶切，同时用NcoI和BglII双酶切连接在T载体上的865 bp启动子序列；回收后将携带有1391 bp启动子序列的pCAMBIA1301载体与865 bp启动子序列连接；然后转化大肠杆菌DH5a，挑取单克隆摇菌PCR检测正确的单克隆提质粒，酶切鉴定，获得ZmERF1基因启动子全长序列2217bp;d. 玉米自交系N04 ZmERF1基因启动子序列分析将克隆得到的ZmERF1基因启动子序列进行顺式元件的预测分析，结果显示该启动子除具有植物启动子的典型特征外，还含有乙烯响应相关的元件2个以及ABA激素应答ABRE元件1个；脱水相关MYB1AT元件4个、MYCATERD元件1个和MYCATRD元件1个；低温抗寒调控元件18个、CBFHV元件8个；伤害调控WBOXNTERF元件9个；热休克CCAATBOX元件1个；组织特异性表达调控CAATBOX元件27个；种子发育相关EBOXBNNAPA元件18个；淀粉酶相关AMYBOX2元件1个、CGACGOSAMY元件1个；糖相关WBOXHVISO元件5个；调控根毛发育相关RHERPATEXPA元件2个。