[发明专利]hTERT重组慢病毒永生化人脱落乳牙牙髓干细胞系的方法

摘要

hTERT重组慢病毒永生化人脱落乳牙牙髓干细胞系的方法，包括以下步骤：步骤一、原代人脱落乳牙牙髓干细胞SHED的原代培养：步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化人脱落乳牙牙髓干细胞hTERT-SHED的构建，本发明利用构建的表达hTERT基因的永生化基因工程细胞，作为研究人脱落乳牙牙髓干细胞生物学特性的有效细胞模型，有利于深入研究在牙周组织工程中作为种子细胞的应用，不同药物对细胞发挥作用和相关机制的信号转导通路，以及利用其筛选有效的治疗慢性牙周炎的中药有效成分，为后续研究牙周组织修复重建的机制、研发新型有效的药物提供有力的工具。

主权项

hTERT重组慢病毒永生化人脱落乳牙牙髓干细胞系的方法，包括以下步骤：步骤一、原代人脱落乳牙牙髓干细胞(SHED)的原代培养：收集儿童牙病科拔除的滞留乳切牙，超净台内用拔髓针尽量完整拔除牙髓组织，将3mg/ml的Ⅰ型胶原酶和4mg/ml的Dispase酶按照体积比为1:1加入培养皿中，用眼科剪将牙髓组织尽量剪碎，置于37℃,5％CO₂,饱和湿度的标准环境细胞培养箱消化60min至组织松散，每隔3‑5d更换培养液一次，培养液成分为体积比79％的DMEM/F12培养基中加入体积比为20％的胎牛血清，体积比为1％的三抗混匀，待有细胞克隆出现，用滤纸片挑取细胞克隆扩大培养，扩大培养的方式是消毒干燥的滤纸片沾湿0.2％胰酶后于克隆位置消化5‑10秒，利用滤纸片将消化下的细胞转移至新的培养皿中继续培养，得到的第2代生长状态佳的人脱落乳牙牙髓干细胞SHED，态均一，呈短梭状、多角形；步骤二、稳定表达hTERT基因的永生化人脱落乳牙牙髓干细胞hTERT‑SHED的构建：取步骤一培养得到的第2代生长状态佳的SHED消化后接种于24孔板，每孔500μL；24h后待细胞贴壁生长，然后再在每孔中加增强感染效率的试剂Enhanced infection solution ENi.S.原液243.25μL、10mg/mL聚凝胺polybrene 0.25μL，以及按照MOI＝65加入携带hTERT基因1*10⁵TU/μL的慢病毒原液6.5μL，混合均匀；24h后换正常培养液，2d后再换含有2μg/mL嘌呤霉素的培养基，隔2d用2μg/mL嘌呤霉素的培养基再换1次，培养观察4d，待未感染细胞在嘌呤霉素作用下全部死亡，再换正常培养基静置培养，每3d换液1次；直到有抗性细胞克隆出现，滤纸片挑取克隆进行扩大培养，得到稳定的感染细胞。