[发明专利]一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法

摘要

一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，它涉及一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法。本发明是要解决现有方法分离、培养的羊膜上皮细胞的纯度低的问题，方法为一、羊膜组织分离和消毒；二、羊膜上皮细胞分离；三、羊膜上皮细胞纯化培养，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成。本发明羊膜组织制成羊膜贴片后可以保证羊膜上皮面平整，同时羊膜背面粘液与结缔组织与硝酸纤维膜紧密贴合，促进胰酶消化效率和细胞与组织的分离，短时间消化即可收集全部羊膜上皮细胞，避免了细胞贴壁率的降低，短时间培养后进行两次胰酶消化，获得了高纯度羊膜上皮细胞。本发明应用于基础研究和临床移植领域。

主权项

一种羊膜上皮细胞分离、培养的方法，其特征在于该方法是按以下步骤完成的：一、羊膜组织分离和消毒：将羊膜自胎盘上剥离，然后用生理盐水冲洗2～3遍，再在含有1％～3％头孢哌酮的生理盐水中浸泡3～10min；二、羊膜上皮细胞分离：将羊膜裁剪成50～150cm2的块状，然后将裁剪后羊膜的上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向培养皿A中加入3～10mL生理盐水，再将羊膜的上皮面朝下贴置在培养皿A中，静置2～3min，获得羊膜贴片；将羊膜贴片置于培养皿B中，加入10～30ml质量浓度为0.25％的胰酶‑EDTA消化15～20min，然后封口膜封口后将培养皿放入恒温摇床中消化，得到消化液，再加入2～5ml胎牛血清终止酶反应，然后去除羊膜贴片上团聚、黏连的羊膜上皮细胞，再将羊膜贴片转移至装有生理盐水的培养皿C中，清洗贴壁的羊膜上皮细胞，得到清洗液，收集消化液和清洗液，经100目细胞筛过滤，获得羊膜上皮细胞单细胞悬液；三、羊膜上皮细胞纯化培养：将步骤二获得的羊膜上皮细胞单细胞悬液在4℃、1500rpm的条件离心5～15min，弃上清，然后加入含有表皮生长因子的低糖DMEM/F12培养基重悬细胞，混匀后按0.9～1.1×105/cm2的接种量接种于培养瓶中，再置于37℃、CO2体积浓度为5％的培养箱中培养，细胞融合率达到85％后，弃除非贴壁细胞，并用生理盐水冲洗2次，然后加入质量浓度为0.05％的胰酶‑EDTA消化，37℃消化2～5min，弃除消化液，再用生理盐水冲洗1～2次，然后加入质量浓度为0.25％的胰酶‑EDTA，在37℃条件下消化3～6min，再加入FBS终止酶反应，收集消化液，将消化液在4℃、1500rpm旋转震荡的条件下离心5～15min，弃上清，然后加入DMEM/F12培养基重悬细胞，得到高纯度P0代羊膜上皮细胞单细胞悬液，即完成，其中步骤二所述的消化是在37℃，60～120rpm的条件下，消化15～20min。