[发明专利]一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法及其应用

摘要

本发明公开了一种由短链核苷酸介导的DNA组装方法及其应用。本发明组装方法包括：“长序列”的合成，模块载体的准备及组装，骨架载体的改造及组装，短序列的准备，模块载体、改造过的骨架载体、“短序列”的酶切连接一体化反应等步骤。在本发明中，“短序列”为启动子和RBS等调节元件，“长序列”为基因或者载体的复制起始原点等。“短序列”被设计为可以合成的双链DNA链，在组装过程中既可以连接“长序列”又可以作为条码序列决定组装顺序。操纵子中基因的顺序可以通过合成带有不同粘性末端的“短序列”来实现。本发明方法允许多个因子同时参与通路中基因的调控，可以用来构建生物合成通路的组合文库，达到通量优化通路的目的。

主权项

1.一种由短链核苷酸介导的DNA通量组装方法，I)“长序列”的合成：克隆待组装DNA片段作为“长序列”；II)“短序列”的准备：根据“长序列”的末端序列的4个碱基和组装顺序来设计长度小于50bp的正向和反向引物，引物合成后，退火形成3’黏性末端和5‘黏性末端的长度分别为4bp的双链DNA片段并磷酸化处理，作为“短序列”，其中短序列的3’黏性末端与其所连接的“长序列”的5’黏性末端互补，5’黏性末端则决定其排列顺序；III)连接反应：将包括所述的“长序列”、所述的“短序列”的反应体系混合，加入T4连接酶进行连接反应，实现组装目的；其中，所述的“长序列”为II类限制性核酸内切酶位点已无义突变的DNA片段；且所述“短序列”包含不同强度的RBS。