[发明专利]一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST-SSR引物的方法，其包括如下步骤：1)构建转录组文库；2)转录组数据的获得，利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；3)SSR位点查找：结合Perl编程语言方法，对大量序列信息进行批量处理，进行SSR位点查找；4)批量设计EST-SSR引物。选择不同的蕨菜材料对设计的SSR引物进行验证，若有条带检测出，即为成功的SSR引物。应用本方法成功地设计了4063对SSR引物，为鸟巢蕨EST-SSR引物开发进而实现分子标记辅助选择育种提供了新的方法和思路。

主权项

一种基于转录组测序开发鸟巢蕨EST‑SSR引物的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)构建转录组文库：提取鸟巢蕨叶片总RNA，分离mRNA，反转录合成并纯化cDNA，末端修复、加腺嘌呤核苷连接测序接头，通过琼脂糖凝胶电泳回收大小为200～700bp的片段，将回收片段进行PCR扩增，即构建得到转录组文库；2)转录组数据的获得：将步骤1)得到的转录组文库用Illumina HiSeq^TM2000平台进行测序，采用Illumina双末端测序方法，获得转录组测序数据；利用Trinity软件对测序数据进行拼接，将序列拼接成一个完整的转录组；3)SSR位点查找：安装Perl语言，从http://pgrc.1pk‑gatersleben.de/misa下载est_trimmer.pl并运行以去除所述转录组序列中小于100bp的短序列和大于2000bp的长序列；从http://www.bioinformatics,org/cd‑hit/中下载CD_HIT软件，利用其去除冗余序列；从http://pgrc.1pk‑gatersleben.de/misa下载使用MISA软件以查找和定位序列中SSR位点，参数设置如下：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的重复次数至少为10、8、5、4、3和3；4)设计EST‑SSR引物：使用软件primer3.0http://sourceforge.net/projects/primer3/files/primer3/l.1.4/primer3‑1.1.4‑WINXP.zip/download批量设计SSR引物，设定标准为：引物长度为18～23bp，GC含量为40％～60％，Tm值55℃～65℃，并且上下游引物Tm值相差不超过5℃，产物大小为150～400bp。