[发明专利]一种sgRNA的设计方法及构建的慢病毒载体、质粒有效
| 申请号： | 201510281885.1 | 申请日： | 2015-05-26 |
| 公开（公告）号： | CN104928292B | 公开（公告）日： | 2019-06-14 |
| 发明（设计）人： | 张健萍;张孝兵;程涛 | 申请（专利权）人： | 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） |
| 主分类号： | C12N15/113 | 分类号： | C12N15/113;C12N15/867;C12N15/85 |
| 代理公司： | 天津滨海科纬知识产权代理有限公司 12211 | 代理人： | 张会雪 |
| 地址： | 300020 *** | 国省代码： | 天津;12 |
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| 摘要： | 本发明涉及一种sgRNA的设计方法及构建的慢病毒载体、质粒，该方法中，sgRNA设计的长度为17bp或18bp，sgRNA的末端带有G或A；靶序列为(N16)GNGG、(N16)ANGG、(N16)CNCC或(N16)TNCC；当第一个碱基为A、C或T，在前面加g。在TagScan数据库中搜索基因组中是否有类似序列；对于17bp长的sgRNA，当另有完全匹配的序列，抛弃该sgRNA，再测试其他合适序列；对于18bp长的sgRNA，当另有且只有1个非匹配核苷酸的序列，也抛弃该sgRNA，继续测试其他具有设计的sgRNA序列。本发明优化设计sgRNA的方法，可导致高敲除效率但低脱靶或无脱靶。 | ||
| 搜索关键词： | 一种 sgrna 设计 方法 构建 病毒 载体 质粒 | ||
【主权项】：
1.一种Cas9－sgRNA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：在克隆过程中，下述元件被依次插入到慢病毒载体骨架中：U6、sgRNA、EF1、Cas9、2A、Puro、WPRE，sgRNA的表达由人U6启动子驱动，Cas9和Puro由EF1启动子驱动，Cas9和Puro由自断裂多肽2A链接，Wpre位于Cas9和Puro下游，sgRNA的设计方法包括：sgRNA设计的长度为17bp或18bp，sgRNA的末端带有G或A；靶序列为(N16)GNGG、(N16)ANGG、(N16)CNCC或(N16)TNCC；当第一个碱基为A、C或T，在前面加g；该方法还包括：在TagScan数据库中搜索基因组中是否有类似序列；对于17bp长的sgRNA，当另有完全匹配的序列，抛弃该sgRNA，再测试其他合适序列；对于18bp长的sgRNA，当另有且只有1个非匹配核苷酸的序列，也抛弃该sgRNA，继续测试其他具有设计的sgRNA序列。
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