[发明专利]一种降香黄檀黑痣病菌分子检测引物及快速检测方法

摘要

本发明属于植物病害的分子检测领域，具体涉及一种降香黄檀黑痣病菌的分子检测引物及其检测方法。采用设计出的一对降香黄檀黑痣病菌特异引物经过巢式PCR扩增，PCR产物扩增分析，琼脂糖凝胶电泳和结果判定。若样本中存在黄檀黑痣菌，在紫外光下琼脂糖凝胶中会出现一条273bp的目的条带，若未出现条带，则代表不存在黄檀黑痣菌。本发明的引物特异性强，可以区分黄檀黑痣菌、禾草黑痣菌、刚竹黑痣菌以及分离自降香黄檀、大果紫檀的其他病原菌及内生真菌；该引物灵敏度高，可检测下限至100ag/μL的黄檀黑痣菌基因组DNA；本发明快速，8小时内即可得到准确的检测结果，而利用传统的病害诊断方法至少需要4天或1周以上。

主权项

一种降香黄檀黑痣病菌的快速分子检测方法，其特征在于，包括下列步骤：1)提取降香黄檀叶片基因组DNA；2)巢式PCR反应：第一轮PCR反应：以ITS4/ITS5为引物进行第一轮PCR；扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL，步骤1)制备的降香黄檀叶片总DNA 1μL，10μmol/L上游引物及下游引物各1μL，最后用ddH2O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；所述的引物ITS4/ITS5序列如下：ITS4：5'‑TCCTCCGCTTATTGATATGC‑3'；ITS5：5'‑GGA AGGTAA AAG TCA AGG‑3'；第二轮PCR反应：以P1/P2为引物进行第二轮PCR反应，扩增反应体系为：2×Taq PCR MasterMix 12.5μL、1μL第一轮PCR扩增产物、10μmol/L引物P1/P2各1μL，最后用ddH2O补足至25μL，离心15sec后置于PCR仪中进行扩增；PCR反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min；上游引物：P1:5'‑CGAGGTCAGAATCAAACG‑3'下游引物：P2:5'‑TGAAGAACGCAGCGAAAT‑3'；3)PCR扩增产物分析取步骤2)扩增产物，经溴化乙锭染色后在凝胶成像系统上成像；4)结果判定根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出273bp的产物，即可判断植物组织中存在黄檀黑痣菌。