[发明专利]一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2‑单磷酸类脂A的制备与应用

摘要

本发明公开了一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2‑单磷酸类脂A的制备与应用，属于生物工程领域。本发明改造大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的、五链Kdo2‑单磷酸类脂A，这种Kdo2‑类脂A分子不连有核心多糖长链、仅由两个2‑酮‑3‑脱氧辛酸、五条脂肪酸链和C4’位单个磷酸构成。该Kdo2‑类脂A具有双亲性质，便于分离提取和纯化，能够被实施检测和直接鉴定，且保持了类脂A部分的生物免疫活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供的提取和纯化该Kdo2‑类脂A的方法，步骤简单明了，易于操作。

主权项

一种生产低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2‑单磷酸类脂A的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)摇瓶发酵培养菌体，(2)收集菌体，氯仿/甲醇/水混合相体系提取分离单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2‑类脂，(3)DEAE纤维柱纯化单磷酸五条脂肪酸链的减毒Kdo2‑单磷酸类脂A；步骤(1)采用基因工程菌进行发酵培养，所述基因工程菌的基因型为E.coli W3110△waaCF△lacI△lpxMlacZ::FnlpxE；所述低毒的、含有五条脂肪酸链的Kdo2‑单磷酸类脂A化学式为C96H175N2O35P，其结构包含2个α‑酮基‑3‑脱氧‑D‑甘露辛酸、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基团和5条脂肪酸链，是以β‑(1’‑6)连接的D‑葡萄糖胺二糖为骨架，6’位连接二α‑酮基‑3‑脱氧‑D‑甘露辛酸，4’位被磷酸化，2’位氨基连接(R)‑3‑(十二烷氧基)十四烷基，3’位、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成，其结构式如式1所示；所述基因工程菌的构建包括如下步骤：1)将人工构建的lacI敲除片段转化入E.coli W3110/pKD46感受态细胞中，获得突变株E.coli W3110lacI::Pkan，通过Cre酶介导的loxP位点特异性重组去除卡那霉素抗性基因；2)FnlpxE片段电转入步骤1)制备的E.coli W3110 △lacI/pKD46感受态细胞中，获得重组菌，其基因型为E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE‑Fkan，通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，构建成中间菌株HW001；3)在HW001突变株的基础上转入人工构建的lpxM敲除片段转化入HW001/pKD46感受态细胞中，获得重组菌E.coli W3110△lacIlacZ::FnlpxE lpxM::Pkan，再次通过Cre酶介导的loxP位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，构建成中间菌株HW002；4)在HW002突变株的基础上将人工构建的waaCF敲除片段转化入HW002/pKD46感受态细胞中，获得重组菌E.coli HW002waaCF:Pkan，再次通过FLP酶介导的FRT位点的特异性重组分别去除其中的卡那霉素抗性基因，最终基因型为E.coli W3110△waaCF△lpxM△lacIlacZ::FnlpxE，构建成基因工程菌株BW002；lacI敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；构建的FnlpxE‑Fkan插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；构建的lpxM敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；构建的waaCF敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述步骤(3)的DEAE纤维柱纯化是用6倍体积的体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/水平衡DEAE吸附柱；用一倍体积的体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/水溶液洗出Kdo2‑类脂A粗样，上样到柱子中；待样品流至填料上端时，用体积比为2:3:1的氯仿/甲醇/醋酸铵溶液进行阶段洗脱，其中水相醋酸铵的浓度梯度分别取60mM、120mM、240mM、360mM、480mM；收集洗脱液并添加适量的氯仿和水，使洗脱液变成Bligh‑Dyer二相体系，静置30mins，取下相，氮吹。