[发明专利]人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 201510287275.2 | 申请日： | 2015-05-28 |
| 公开（公告）号： | CN105713866B | 公开（公告）日： | 2020-05-22 |
| 发明（设计）人： | 罗敏华;谌章舟;柳中洋;赵非;阮强;朱桦 | 申请（专利权）人： | 中国科学院武汉病毒研究所 |
| 主分类号： | C12N7/01 | 分类号： | C12N7/01;C12N15/65;C12N15/85;C12Q1/70;C12Q1/686;G01N33/68;G01N33/569 |
| 代理公司： | 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 | 代理人： | 栾波 |
| 地址： | 430071 湖北*** | 国省代码： | 湖北;42 |
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| 摘要： | 本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及人巨细胞病毒感染性克隆及其构建方法和应用。该方法包括将绿色荧光蛋白基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；以野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR扩增其左右同源重组臂，将产物经过纯化、酶切后再进行连接和PCR，得到的左右同源重组臂全长序列与带有GFP的BAC载体连接后，经酶切线性化转染经野生型HCMV Han病毒感染的HEL细胞，传代培养后提取细胞总DNA；并电转化至感受态细胞中在抗性的培养基培养即得。该感染性克隆产生的重组病毒的生物学特性与野生型病毒相似，且还可以通过GFP报告基因的表达来观察病毒株感染性克隆在细胞内的感染情况。 | ||
| 搜索关键词： | 巨细 病毒 感染性 克隆 及其 构建 方法 应用 | ||
【主权项】：
一种人巨细胞病毒感染性克隆的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、将绿色荧光蛋白基因插入到BAC中，得到带有GFP的BAC载体；2)、以野生型HCMV Han病毒基因组为模板，PCR分别扩增左右同源重组臂，将扩增产物分别依次经过纯化、酶切后再进行连接和PCR扩增，得到同源重组臂全长序列；3)、将所述同源重组臂全长序列与所述带有GFP的BAC载体进行连接后通过转化、质粒提取以及酶切线性化处理，得到带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒；4)、用野生型的HCMV Han病毒感染转染HEL细胞，并利用所述带有HCMV Han同源序列的线性化BAC穿梭质粒转染感染的HEL细胞，再经过传代培养后提取发生了同源重组且带有HCMV Han‑BAC重组病毒基因组的细胞总DNA；5)、将所述带有HCMV Han‑BAC重组病毒基因组的细胞总DNA电转化至感受态细胞DH10B中，并在含有氯霉素抗性的培养基培养，得到人巨细胞病毒感染性克隆。
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