[发明专利]一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种基于聚丙烯酰胺凝胶电泳检测低效率基因组编辑的方法及其应用。该方法包括如下步骤：1)将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；2)将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；3)用聚丙烯酰胺凝胶电泳杂交产物，确定待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测。该方法在保证人工核酸内切酶编辑效率检测准确性、灵敏性的同时，简化了实验操作且降低了检测成本，将对人工核酸内切酶在基因定点修饰、基因功能研究以及疾病动物模型的建立等方面的应用产生积极地推动作用。

主权项

1.一种基因编辑后的DNA产物的检测方法，包括如下步骤：1）将待测基因编辑后DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，并将所述PCR扩增产物变性、复性，得到杂交产物；所述变性和复性的条件如下：第1个循环，95 °C 10 min；第2个循环，95–85 °C, −2 °C s⁻¹ ；第3个循环，85 °C, 1 min ；第4个循环，85–75 °C, −0.3 °C s⁻¹；第5个循环，75 °C, 1 min ；第6个循环，75–65 °C, −0.3 °C s⁻¹；第7个循环，65 °C, 1 min ；第8个循环，65–55 °C, −0.3 °C s⁻¹；第9个循环，55 °C, 1 min；第10个循环， 55–45 °C, −0.3 °C s⁻¹；第11个循环，45 °C, 1 min；第12个循环， 45–35 °C, −0.3 °C s⁻¹；第13个循环， 35 °C, 1 min；第14个循环，35–25 °C, −0.3 °C s⁻¹；第15个循环，25 °C, 1 min；所述待测基因编辑后DNA为将野生型DNA用人工核酸内切酶编辑，得到由突变DNA和未突变野生型DNA组成的待测基因编辑后DNA；所述人工核酸内切酶为锌指核酸内切酶、类转录激活因子效应物核酸酶或CRISPR/Cas9；2）用浓度为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳所述杂交产物，检测电泳结果，根据分子量大小及构象差异，确定所述待测基因编辑后DNA中突变DNA和未突变野生型DNA，实现基因编辑后DNA的检测；所述电泳采用的电压为110V；所述杂交产物的大小为580‑780bp；所述待测基因编辑后DNA中，所述未突变野生型DNA的质量百分含量大于所述突变DNA的质量百分含量；所述突变DNA的质量百分含量为0.1‑0.45 %。