[发明专利]CRISPR/Cas9和Cre/lox系统编辑伪狂犬病毒基因组制备疫苗方法和应用

摘要

本发明公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑系统和Cre/lox重组系统编辑伪狂犬病毒基因组快速制备疫苗的方法及其应用；该方法利用CRISPR/Cas9基因编辑系统同时高效地将GFP基因和mCherry基因分别重组到伪狂犬病毒gE基因和TK基因位点，得到gE基因和TK基因的条件性缺失毒株。纯化后，再利用Cre/lox系统将伪狂犬病毒重组毒基因组中的外源GFP和mCherry基因切除，进而快速纯化得到缺失gE/TK双基因缺失的伪狂犬病毒活疫苗。对多基因同时进行操作，将传统方法中多基因敲除的多轮流程，缩减到一轮；同时，CRISPR/Cas9和Cre/lox系统对病毒基因的高效率编辑，将三十代左右的空斑纯化过程，简化到3‑4代，大幅提高了病毒疫苗制备的效率，是有效防控变异伪狂犬病毒更大范围流行和减少重大经济损失的有力保证。

主权项

1.制备缺失gE基因和TK基因的伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)分离和纯化野生型伪狂犬病毒；2)伪狂犬病毒gE基因和TK基因sgRNA的设计；分别在gE基因和TK基因上选择符合5’‑GN(20)GG、5’‑GN(18)GG、5’‑GN(17)GG、5’‑N(21)GG、5’‑N(20)GG或者5’‑N(19)GG的序列规则的位点；通过BLAST工具比对，确定gE‑sgRNA序列SEQ ID NO.1和TK‑sgRNA序列SEQ ID NO.2；3)将gE‑sgRNA双链寡核苷酸和TK‑sgRNA双链寡核苷酸分别连接到Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体中：分别在gE‑sgRNA和TK‑sgRNA的序列基础上，在正向寡核苷酸Forward oligo 5’端加上CACC，在其逆向寡核苷酸Reverse oligo 5’端加上AAA，设计得到一对单链寡聚核苷酸：Forward oligo：5’‑CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN；Reverse oligo：CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA‑5’；分别合成gE‑sgRNA双链寡核苷酸和TK‑sgRNA双链寡核苷酸；成对变性、退火，退火之后形成具有粘性末端的DNA双链，可连入经Bbs1酶切线性化的U6真核表达载体中，其序列为SEQ ID NO.3；得到连接产物；4)将上述连接产物转化感受态细胞，挑选单克隆菌落；DNA测序鉴定阳性克隆；培养阳性克隆并提取质粒，分别得到gE‑sgRNA和TK‑sgRNA的表达载体；5)在体外扩增伪狂犬病毒gE基因上游同源臂gEhm1序列SEQ ID NO.4和下游同源臂gEhm2序列SEQ ID NO.5，纯化回收、PCR验证；6)在体外扩增伪狂犬病毒TK基因上游同源臂TKhm1序列SEQ ID NO.6和下游同源臂TKhm2序列SEQ ID NO.7纯化回收、PCR验证；7)在体外扩增GFP基因序列SEQ ID NO.8和mCherry基因序列SEQ ID NO.9，纯化回收，PCR验证；8)将上述得到的GFP基因和mCherry基因分别插入线性化的loxP载体和线性化的loxN载体中，PCR扩增分别得到loxP‑GFP‑loxP片段和loxN‑mCherry‑loxN片段；9)融合PCR扩增分别得到gEhm1‑loxP‑GFP‑loxP‑gEhm2序列SEQ ID NO.10和TKhm1‑loxN‑mCherry‑loxN‑TKhm2序列SEQ ID NO.11；10)按磷酸钙转染法或者脂质体转染法，将同源重组片段与sgRNA表达载体混合转染；其中，转染量比例为：gEhm1‑loxP‑GFP‑loxP‑gEhm2片段、TKhm1‑loxN‑mCherry‑loxN‑TKhm2片段、gE‑sgRNA载体和TK‑sgRNA载体＝0.5︰0.5︰2︰2；11)转染细胞孵育完成后，感染伪狂犬病毒野毒株，纯化得到重组伪狂犬病毒；12)按磷酸钙转染法或脂质体转染法，将Cre重组酶表达载体转染293T细胞，12h后感染重组伪狂犬病毒得到伪狂犬双基因缺失毒，纯化后得到缺失gE基因和TK基因的双缺少伪狂犬病毒毒株，即伪狂犬双基因编辑病毒疫苗株。