[发明专利]一种外源蛋白原核分泌表达系统及其应用

摘要

本发明涉及一种外源蛋白原核分泌表达系统，由工程菌和载体两部分组成。首先以能高效胞外分泌SMP蛋白的D2野生株为出发菌，定点敲除了SMP蛋白编码基因，获得的突变株为工程菌，保藏号为CGMCC No.10365；同时以同源重组质粒pEX18Tc为基础构建了含有同源臂、SMP信号肽、多克隆位点的新质粒pEX18S，作为表达系统的载体；将外源基因插入到新质粒中即可将其整合到D2突变株基因组中的原smp基因所在位置，并进行高效胞外分泌表达。本发明的优点是：能够以胞外分泌的方式大量生产外源目的蛋白，且易于纯化、操作简便，具有较高的推广和应用价值。

主权项

1.一种外源蛋白原核分泌表达系统，其特征在于，包含工程菌和同源重组载体，其中该工程菌为嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株，其smp基因被定点敲除，该同源重组载体命名为pEX18S，其序列如SEQ ID No:1所示，所述pEX18S以同源重组质粒pEX18Tc为骨架，按5'→3'将pEX18Tc的原多克隆位点的Hind Ⅲ和EcoR Ⅰ间的序列替换为嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因的上游同源臂序列、新的多克隆位点、嗜麦芽寡养单胞菌D2株的smp基因下游同源臂序列，其中上游同源臂序列内含有嗜麦芽寡养单胞菌D2株的信号肽序列；其中，所述嗜麦芽寡养单胞菌D2△smp缺失株，其菌种分类名称为：嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)D2smpmutant，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年01月19日，保藏编号：CGMCC NO:10365；其中，所述同源重组载体pEX18S的制备方法包括如下步骤：步骤1.基因组DNA的提取将嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株接种于LB液体培养基中过夜培养，用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA；步骤2.smp基因缺失片段的制备1)引物设计根据嗜麦芽寡养单胞菌D2野生株smp基因开放读码框架两侧的序列分别设计上、下游同源臂的扩增引物，以扩增获得不含smp基因序列的片段，上游同源臂扩增引物：正向引物UP‑F：核苷酸序列如SEQ ID No:2所示；反向引物UP‑R：核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；下游同源臂扩增引物：正向引物DOWN‑F：核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；反向引物DOWN‑R：核苷酸序列如SEQ ID No:5所示；2)PCR分别扩增上、下游同源臂：其中，模板为步骤1提取的基因组DNA，引物为上、下游同源臂扩增引物UP‑F和UP‑R、DOWN‑F和DOWN‑R；反应体系50μL，其组成：模板2.0μL，HS DNA Polymerase 0.5μL，浓度为5U/μl，2×PrimerGC Buffer 25μL，dNTP 4.0μL，其中每种浓度为2.5mmol/L，dd H2O 15.5μL，引物各1.5μL，引物浓度为10μmol/L；PCR扩增参数：94℃预变性5min；98℃10s，60℃5s，72℃40s，30个循环；72℃延伸10min；3)上、下游同源臂扩增产物的纯化使用PCR产物纯化试剂盒对上、下游同源臂扩增产物进行纯化；4)SOE PCR连接PCR引物为上游同源臂的正向引物UP‑F和下游同源臂的反向引物DOWN‑R，模板为上、下游同源臂纯化产物；扩增体系：模板各1μL；浓度为5U/μL的PrimerHS DNA polymerase 0.5μL，2×PrimerGC Buffer 25μL，dNTPs 4.0μL，其中每种浓度为2.5mmol/Ldd H2O 15.5μL，引物各1.5μL，引物浓度10μmol/L；PCR扩增参数：94℃预变性5min；98℃10s，60℃5s，72℃1min10s，30个循环；72℃延伸10min；获得smp基因缺失片段并纯化，纯化方法与纯化上、下游同源臂扩增产物相同；步骤3.同源重组载体pEX18S的构建1)双酶切将步骤2获得的smp基因缺失片段和pEX18Tc质粒分别进行Hind Ⅲ/EcoR Ⅰ双酶切，酶切体系20μL体系：10×buffer 2.0μL，smp基因缺失片段或pEX18Tc质粒5.0μL，HindⅢ1.0μL，EcoRⅠ1.0μL，dd H2O 11μL；反应条件：37℃水浴30min，获得酶切产物，所述酶切产物为线性pEX18Tc质粒或双酶切后的smp基因缺失片段；2)酶切产物的纯化：使用凝胶回收试剂盒分别纯化回收上述酶切产物：3)连接获得同源重组载体pEX18S反应体系：10×T4 DNA Ligase buffer 1μL，T4DNA Ligase 1μL，线性pEX18Tc质粒1μL，双酶切后的smp基因缺失片段4μL，dd H2O 3μL，合计：10μL，反应条件：16℃过夜，获得同源重组载体pEX18S。