[发明专利]外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法

摘要

本发明公开一种外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离细胞，配制成一定细胞密度的细胞悬液；在植入育珠蚌的珠核表面粘附一层厚度基本均匀的高分子聚合物组织工程支架，与游离的珍珠贝外套膜细胞在体外一起培养，使外套膜细胞粘附在珍珠核表面的组织工程支架纤维中分裂生长，待细胞在组织工程支架中生长、增殖，围绕珠核表面形成一个细胞基本均匀分布的珍珠囊后，将珠核移植到育珠蚌体内，在珍珠养殖场中养殖培养珍珠。本发明解决了传统外套膜细胞小片植入法存在的细胞在珠核周围迁移后分布不均匀导致异形珍珠的问题，也使得珍珠核与育珠蚌的相容性很好。

主权项

一种外套膜游离细胞与组织工程支架珠核在体外共培养后植核培育珍珠的方法，其特征是，将珍珠贝的外套膜组织用酶消化法分离成单个存在的游离细胞，配制成一定细胞密度的细胞悬液；在植入育珠蚌的珠核表面粘附一层厚度基本均匀的高分子聚合物组织工程支架，与游离的珍珠贝外套膜细胞在体外一起培养，使外套膜细胞粘附在珍珠核表面的组织工程支架纤维中分裂生长，待细胞在组织工程支架中生长、增殖，围绕珠核表面形成一个细胞基本均匀分布的珍珠囊后，将珠核移植到育珠蚌体内，在珍珠养殖场中养殖培养珍珠；具体包括以下步骤：（1）将打磨好的普通珍珠核高压灭菌处理，放入0.01 wt %~0.1 wt %的多聚赖氨酸溶液或胶原蛋白中浸泡10~30分钟，取出，无菌条件下晾干；（2）制备珠核组织工程支架层模具：所述模具由模具Ⅰ和模具Ⅱ组成，模具Ⅰ由两个结构一样的中空半球构成，每个半球的内侧面有3条突起的棱，其中2条棱分别位于半球两侧边缘，另一条棱位于半球的中间，棱的长度为球体周长的1/2，3条棱的末端在球的南北极端相交，南极端相交处的棱切除部分形成凹口作为注胶孔，棱的高度（H）为0.02~2mm，边缘棱宽度为中间棱的一半；棱的作用在于支撑珍珠核，使将珍珠核放入模具后珍珠核与半球内面之间的高度一致，棱的高度（H）就是要填充的组织工程支架的厚度；使用时，先将珍珠核放入一个半球中，然后将另一半球合拢，两个半球的边缘棱在两半球合拢后其侧面拼接在一起合为一条宽度与中间棱宽度一样的棱，两个半球合拢成一个球体，棱一端的球面是封闭的，而位于另一端的球面处留出一小孔作为注胶孔用于灌注组织工程支架液，此端对接处的棱切除部分，留出孔道使组织工程支架液能从此孔道同时灌注到模具中被棱隔开的4个空间中；模具Ⅰ用于完成珍珠核组织工程支架制备的第一步，得到有凹槽的组织工程支架珍珠核；模具Ⅱ由两个中空的半球组成，其内侧表面无突起结构，半球内径为珍珠核直径和模具Ⅰ棱高度的2倍之和，两半球合拢后留有一注胶孔用于灌注组织工程支架液，利用模具Ⅱ完成凹槽的填补，得到组织工程支架层厚度相同的球形组织工程支架珍珠核；（3）无菌条件下配制组织工程支架液：无菌条件下将胶原蛋白配制成浓度为1.0wt%~3.0wt%的溶液，待胶原蛋白完全溶解后向其中加入2.5vol%的戊二醛溶液作为交联剂，使戊二醛终浓度为0.01vol%~0.05vol%，搅拌均匀；（4）支架制备：先将步骤（1）晾干好的珠核放置于模具Ⅰ中，将步骤⑶制备的组织工程支架液灌注入模具，振荡摇匀10分钟，室温下静置2~12小时使组织工程支架液交联，降温至4℃、10分钟后使珠核脱模；然后打开模具取出珠核，再放置入模具Ⅱ中，使组织工程支架的凹槽的凹口处对准注胶孔，再注入步骤（3）制备的组织工程支架液，以使第一次注胶时留下的凹槽填满组织工程支架液，室温下静置2~12小时使组织工程支架液交联；然后取出，将注胶孔处的表面磨平，在‑20 ℃条件下放置1~6小时冷冻成型，然后放入冷冻干燥机中真空干燥2~24小时，真空度为12~20 Pa，冻干温度为‑20~‑70℃；将珠核浸泡于蒸馏水中洗去残留的戊二醛；（5）外套膜游离细胞获取：清洗蚌壳，撕取珍珠蚌的外套膜组织，切除边缘色线部分，洗涤消毒后剪成约1mm2小块，采用胰酶消化法消化组织块，用200 目绢网过滤去除残留的组织块，1000r/分钟离心分离出细胞，加入培养液吹散细胞沉淀，得到珍珠贝的外套膜组织游离细胞；（6）将步骤⑷处理后的珠核与外套膜分离的游离细胞一起在恒温培养箱中体外培养，培养液为完全培养液，采用RPM1640或M199或DMEM，加入10~30 wt %的血清，血清采用蚌血清、孕马血清或牛血清；培养温度26~37℃，培养时间3~6天，其间多次更换培养液以保证细胞分裂生长，细胞贴附在珠核表面的组织工程支架层中分裂增殖2~6次，使组织工程支架空间中充满细胞；（7）倒去培养液，用PBS缓冲液冲洗珠核，去除未粘附在组织工程支架上的细胞，然后直接将珠核植入育珠蚌体内的植核位置，按常规有核珍珠培育方法培育珍珠。