[发明专利]一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法

摘要

本发明公开了一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤。本发明基于发明人2014年从烟草的叶和花中鉴定出17种类黄酮物质，其中9种为烟草中首次被鉴定出来，使得建立了其中14种类黄酮物质的定量分析方法，本发明方法的建立对于开展烟草花瓣中类黄酮物质的相关研究具有重要意义。

主权项

一种定量分析烟草花瓣中14种类黄酮物质的检测方法，其特征在于所述14种类黄酮物质为二氢山奈酚、二氢槲皮素、山奈酚、槲皮素、柚皮素、芸香苷、山奈酚‑3‑O‑芸香糖苷、异鼠李素、槲皮素‑3‑O‑葡萄糖苷、木犀草素、异鼠李素‑3‑O‑葡萄糖苷、异鼠李素‑3‑O‑芸香糖苷、山奈酚‑3‑O‑葡萄糖苷、柚皮素‑7‑O‑葡萄糖苷；所述检测方法包括样品前处理、供试品溶液的制备、对照品溶液的制备和测定步骤，具体包括：A、样品前处理：将待检样品烟草花瓣研磨、冷冻干燥后置于1~4℃保存备用；B、供试品溶液的制备：准确称取10.0mg的前处理后的样品，加入体积比5:2:2的甲醇‑氯仿‑水提取剂1mL和内标溶液200μL，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，内标溶液浓度为1.0μg/mL，超声30min、离心后取上清液作为供试品溶液；C、对照品溶液的制备：分别精密称定各标准化合物，即14个标准样品和3个内标物黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，得到1mg/mL的类黄酮单标溶液，分别移取100μL 1mg/mL的低浓度类黄酮单标溶液以及10mL 1mg/mL的高浓度类黄酮单标溶液于100mL容量瓶中，以样品提取溶液，即甲醇‑氯仿‑水提取溶液定容制备得到标准混合溶液，以样品提取溶液逐级稀释标准混合溶液，制成低浓度类黄酮物质浓度为1000、600、400、100、60、40、10、6、4、1ng/mL，体积为1mL的标准溶液梯度；此梯度对应的高浓度标准溶液梯度为100、60、40、10、6、4、1、0.6、0.4、0.1μg/mL；在上述所有浓度梯度的溶液中加入200μL的内标溶液得到对照品溶液，内标溶液为黄豆苷元、染料木苷和橙皮苷的水溶液，浓度为1.0μg/mL；D、测定：进行色谱质谱分析，色谱分析条件：15cm×2.1mm、1.7μm粒径的Waters BEH C18色谱柱；A相，水；B相，乙腈，两相均添加0.1%的甲酸和0.2mmol/L的醋酸铵；流动性梯度，0‑1min，10%B；1‑9min，10%B‑90%B；9‑11min，90%B‑100%B；11‑11.1min，100%B‑10%B；11.1‑13min，保持10%B；柱温30℃，进样量2μL，流速0.25mL/min；质谱分析条件：电喷雾电离离子源；喷雾电压‑4000V；帘气压力40psi；离子源温度700℃；辅助气1为60psi；辅助气2为50psi；去簇电压‑100V；化合物定量离子及能量见表1，表1 类黄酮物质分析质谱定量离子及碰撞能量以待测14个类黄酮化合物的含量为横坐标，以其对应的色谱峰面积与内标化合物的色谱峰面积的比值为纵坐标，建立工作曲线，对校正数据进行线性回归，求得类黄酮物质的回归方程，试样中类黄酮物质的含量按下式进行计算：式中：c为烟草花瓣样品中类黄酮物质的含量，单位μg/g；x为仪器测得的供试品溶液的浓度。