[发明专利]一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法

摘要

本发明为一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法。这种方法是通过水溶性阳离子共轭聚合物(简称CP)来检测光敏剂的光动力抗菌能力，CP结构式如式(I)如下，其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n＝8–20。利用CP的荧光淬灭程度对细菌的数量进行定量检测，从而对抗菌光敏剂的功效进行筛选。本发明与传统的筛选方法相比，具有精确、快速、简便、经济、直接等特点。通过水溶性共轭聚合物分子的荧光淬灭效率可以定量的测定细菌的数量，并利用其可以对光动力抗菌光敏剂的抗菌功效进行高通量筛选。

主权项

一种高通量筛选光动力抗菌光敏剂的方法，其特征为包括以下步骤：（a）将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0 OD；（b）将光敏剂溶液，加入溶液a中，使光敏剂的浓度为0.1–100.0 μM，室温下，光照孵育1–20分钟，光强度为50–150 mW/cm2，得到溶液b；（c）将培养基加入所获溶液b中，37°C下孵育1‑5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1~3；（d）取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10 min，得到溶液d；其配比为每20 μL步骤（c）得到的溶液中加入100~200 μL检测缓冲溶液；加入共轭聚合物溶液使得溶液d中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0 μM；（e）用紫外灯下照射溶液d，与相同条件下参比溶液中的聚合物荧光颜色相比较，可以判定光敏剂是否具有抗菌性；或者，根据激发光波长400–450 nm下溶液d的荧光强度值，与相同条件下标准曲线的荧光值的比值，可以判断得到光敏剂作用后的细菌数量，进而判断光敏剂抗菌性的功效，进行筛选；所述的共轭聚合物结构式如式（I）所示：         式（I）其中，R为三甲胺基、三乙胺基或三丙胺基；m取值为1–12；X为Cl、Br、I或F；n为聚合度，n = 8–20；所述的培养基的制备具体为称取2 g 胰蛋白胨、1 g 酵母提取物、2 g NaCl 加入锥形瓶中，加入200 mL 超纯水，高温灭菌后，冷却到室温，3~6摄氏度冷藏待用；所述的光敏剂为卟啉类衍生物、BODIPY化合物、钌多吡啶配合物或共轭聚电解质；所述的带负电的细菌，具体为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸菌、硝化细菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、根瘤菌或金黄色葡萄球菌；所述的步骤a）中的第一缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液；所述的步骤d）中的检测缓冲液为PBS缓冲液、Tris缓冲液、PB缓冲液、HEPES缓冲液或40%醇水；所述紫外灯为365 nm的紫外灯,照射时样品与紫外灯的距离为1–5cm；所述的参比溶液中的聚合物荧光颜色的获得方法，包括以下步骤：（a）将带负电的细菌溶于第一缓冲液中得到溶液a，其浓度为0.5–5.0 OD；（b）取溶液a在室温下，光照孵育2–20分钟，光强度为50–150 mW/cm2，得到溶液b；（c）将培养基加入所获溶液b中，37°C下孵育1‑5小时，得到溶液c；其中，体积比为溶液b：培养基＝1：1~3；（d）取上步得到的溶液c，向其中加入共轭聚合物和检测缓冲溶液，室温下孵育1–10 min，得到溶液d；其中，每步骤（c）得到的溶液20μL加入100 μL检测缓冲溶液，溶液d中共轭聚合物浓度为0.1–100.0μM；（e）用紫外灯下照射溶液d，通过肉眼可观测到参比溶液中的聚合物荧光颜色；所述的标准曲线的荧光值获得方法，包括以下步骤：将浓度相同的共轭聚合物溶液与不同数量的细菌在96孔板中混合，得到一系列细菌浓度为0–5×107 CFU mL‑1孔板溶液，其中，溶液中共轭聚合物的浓度为0.1–100.0 μM数量，然后孵育1min，用多功能酶标仪读取制备完成样品的荧光光谱，激发光为400–450 nm，得到发射光谱为400–800 nm的荧光强度值。