[发明专利]一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其应用

摘要

本发明公开了一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法，将冻存的vero细胞复苏后，置于有血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量的驯化方法驯化vero细胞。本发明采用逐渐减少血清含量的培养方法对vero细胞进行驯化培养，以使vero细胞能适应无血清培养的环境，得到一种能适应无血清培养的vero细胞；驯化后的vero能在VP‑SFM中连续传代培养至少50代。

主权项

1.一种猪流行性腹泻病毒在无血清培养系统中的增殖培养方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）将经适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法培养得到的vero细胞置于VP‑SFM培养液中培养，待适应VP‑SFM培养液的vero细胞长成单层细胞后，倾去VP‑SFM培养液上清，以体积分数为1‑3%的剂量接入猪流行性腹泻病毒，吸附1小时后，加入维持液；然后置于37℃ 体积百分数为5%的CO2培养箱中培养，每天观察单层细胞的病变情况；当70%以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2‑3次，收获病毒液，记录为病毒液F1代；所述适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法为将冻存的vero细胞复苏后置于血清培养基中培养，并采用逐步降低血清含量的方法驯化vero细胞;具体驯化方法包括以下步骤：1）将冻存的vero细胞复苏；2）将复苏后的vero细胞置于血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与消化后的vero细胞的体积比为1:3进行消化传代培养；3）将步骤2）得到的vero细胞置于混合培养液Ⅰ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与消化后vero细胞的体积比为1:（2‑3）进行消化传代培养；4）将步骤3）得到的vero细胞置于混合培养液Ⅱ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅰ，以消化前vero细胞的体积与消化后的vero细胞的体积比为1:（2‑3）进行消化传代培养；5）将步骤4）得到的vero细胞置于混合培养液Ⅲ中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:（2‑3）进行消化传代培养；6）将步骤5）得到的vero细胞置于无血清培养液中进行培养，待vero细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，以消化前vero细胞的体积与经消化后的vero细胞的体积比为1:（2‑3）进行消化传代培养，即得适用于无血清培养系统的vero细胞；所述血清培养液为含体积百分数为8%的胎牛血清的DMEM培养液；所述无血清培养液为含4mM的L‑谷氨酰胺的VP‑SFM培养液；所述混合培养液Ⅰ是由体积百分数为80%的血清培养液和体积百分数为20% 的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液Ⅱ是由体积百分数为50%的血清培养液和体积百分数为50% 的无血清培养液组成的混合培养液；所述混合培养液Ⅲ是由体积百分数为20%的血清培养液和体积百分数为80% 的无血清培养液组成的混合培养液；所述胎牛血清购自gibco公司，批号为1128144；所述DMEM培养液购自Hyclone公司，批号为NZH1194；所述VP‑SFM培养液购自gibco公司，批号为1637720；所述L‑谷氨酰胺购自Sigma公司，批号为WXBB6280v;所述消化液Ⅰ为由质量百分数为0.25%的胰酶和质量分数为0.02%的EDTA的Hank′s液组成的 EDTA‑胰酶消化液；所述消化液Ⅱ为TrypLE select,购自gibco公司，批号为1596842；（2）将步骤（1）中的病毒液F1代再以体积分数为1‑3%的剂量接入适应VP‑SFM培养液的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37℃体积百分数为5%的CO2培养箱中培养，收获的病毒液标记为病毒液F2代；（3）将步骤（2）中的病毒液F2代以体积分数为1‑3%的剂量接入适应VP‑SFM的长成单层的vero细胞中，吸附1小时后，加入维持液，置于37℃体积百分数为5%的CO2培养箱中培养，收获的病毒液标记为病毒液F3代；所述维持液是由体积分数为80%的DMEM和体积分数为20%的无血清培养液组成的混合营养液；所述无血清培养液为含4mM的L‑谷氨酰胺的VP‑SFM培养液。