[发明专利]一种基于足点域和杂交链式反应测定T‑2毒素的方法

摘要

本发明属于化学发光检测技术领域。当含T‑2毒素样品加入到Seq.16/DNA1修饰的磁珠溶液中时，T‑2毒素与Seq.16作用，将DNA1释放下来，磁性分离后将含DNA1的清夜加入倒发卡DNA2修饰的磁珠溶液中，DNA1的3’端与DNA2的5’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA1未杂交的部分与DNA2双链部分继续进行杂交反应，将DNA2的发卡结构打开，并形成新的双链DNA。再加入FITC标记发卡DNA H1和H2后，在光二极管照射作用下产生化学发光，根据化学发光信号强弱实现T‑2毒素的测定。该方法具有高灵敏度，低成本，操作简单等特点。

主权项

一种基于足点域和杂交链式反应测定T‑2毒素的方法，包括以下步骤：(1)取10μL链霉亲和素修饰磁珠至1mL离心管中，并用100μL pH 8.0的Tris‑HCl缓冲溶液清洗两遍，并分散到100μL的Tris‑HCl缓冲溶液中；发卡DNA在使用之前在95℃条件下孵化2min，然后逐步降温至室温备用；(2)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液，然后加入10μL 1.0×10‑5M生物素化的Seq.16，并在37℃下振荡反应1h，然后，再加入10μL 1.0×10‑5M DNA1，得到Seq.16/DNA1修饰的磁珠，并用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；(3)在盛有10μL磁珠的1mL的离心管中加入100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液，然后加入10μL 1.0×10‑5M的DNA2，并在37℃下振荡反应1h，得到发卡DNA2修饰的磁珠，用磷酸缓冲溶液洗涤3遍，并分散于100μL的磷酸缓冲溶液中；(4)在100μL含有Seq.16/DNA1修饰的磁珠溶液中加入T‑2毒素的样品溶液100μL，在37℃下振荡反应，T‑2毒素与Seq.16作用，使得DNA1脱离Seq.16/DNA1修饰的磁珠表面，1h后，磁性分离，取含DNA1的清液加到100μL发卡DNA2修饰的磁珠溶液中，37℃下振荡反应，DNA1的3’端与DNA2的5’端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA1未杂交的部分与DNA2双链部分继续进行杂交反应，将DNA2的发卡结构打开，并形成新的双链DNA，1h后，加入100μL 1.0×10‑7M FITC‑H1和1.0×10‑7M FITC‑H2的溶液，并在37℃振荡反应1h；然后，进行磁性分离，除去清液后，将磁珠用100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液清洗两遍，然后分散于100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液中；取200μL pH 11.3浓度为0.01M的鲁米诺溶液于小烧杯中，并加入上述所得50μL磁珠溶液；打开光二极管电源，照射15秒后关闭电源，测定化学发光强度，根据化学发光强度实现目标物的测定。