[发明专利]一种基于足点域杂交的DNA测定新方法

摘要

一种基于足点域杂交的DNA测定新方法，属于化学发光技术领域。将目标DNA加入DNA1修饰磁珠中，目标DNA的一端与DNA1的一端单链部分杂交形成足点域，在足点域作用下目标DNA未杂交的部分与DNA1继续进行杂交反应，将DNA1的发卡结构打开，同时形成双链DNA，再加入FITC标记DNA2探针，DNA2的一端与所形成的双链DNA的一端单链部分杂交形成足点域，在足点域的作用下DNA2未杂交的部分与双链DNA继续进行杂交反应，形成新的双链DNA，将目标DNA替换下来进行循环利用，并将大量的DNA2附着在磁珠上，利用光二极管诱导化学发光原理实现对目标DNA的测定。本发明方法简单、成本低、灵敏度高。

主权项

一种基于足点域杂交的DNA测定新方法，其特征包括以下步骤：a.发卡DNA在使用之前在95℃温度下孵化2min，并逐步降至室温；b.取10μL链霉亲和素修饰的磁珠至1.5mL的离心管中，用100μL pH 8.0的Tris‑HCl缓冲溶液清洗两遍，然后将其分散到Tris‑HCl缓冲溶液中；c.在含10μL链霉亲和素修饰的磁珠的1.5mL的离心管中，加入10μL 1.0×10‑5M的生物素修饰的DNA1，在37℃下振荡反应30min，并用100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液洗涤两遍，得到DNA1修饰磁珠，并分散到1mL的磷酸缓冲溶液中；d.取c所得磁珠溶液100μL，并加入含有目标DNA的样品溶液100μL，然后再加入100μL含有1.0×10‑7M DNA2的pH为6.8的磷酸缓冲溶液，并在37℃振荡反应1h；然后进行磁分离，除去上清液后，将磁珠用100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液洗涤两遍，并将其分散于100μL pH 6.8的磷酸缓冲溶液中；再加入200μL pH 11.3的鲁米诺溶液，打开光二极管，15秒后关闭光二极管，用化学发光仪检测化学发光信号，根据化学发光信号强度对目标物进行定量分析；其中，DNA1、DNA2和目标DNA的序列如下：DNA1：5’‑biotin‑GCGGTAGGCCGTCCTAATCTCCTCCCCCAACACGGCC‑3’DNA2：5’‑GTTGGGGGAGGAGATTAGGACGGCC‑FITC‑3’目标DNA：5’‑AGATTAGGACGGCCTACCGC‑3’。