[发明专利]一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法

摘要

一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，涉及分子生物学、细胞生物学与微生物学领域，其方法是：（1）抗体包被，（2）封闭，（3）加待检样品，（4）加酶标抗体，（5）加显色液，（6）终止反应，（7）判定结果。有益效果是：本发明制备胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体，由于单克隆抗体具备纯度高、特异性强、可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性的特点，因此以胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体为包被抗体，建立胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法，可以提高检测的特异性与敏感性。对胞内分枝杆菌病的诊断和防制具有重要的现实意义，涉及到畜牧业健康发展和国计民生，具有广阔的发展前景和巨大的市场需求。

主权项

一种检测胞内分枝杆菌的ELISA检测方法，其方法是：（1）抗体包被，用100μL包被液即pH 9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液包被胞内分枝杆菌HBHA单抗隆抗体终浓度为0.2~0.6μg/ml，4℃包被12~24h或37℃孵育1h~2h，甩掉孔内液体；（2）封闭，每孔中加入1%BSA 的100μL封闭液轻轻摇匀，4℃过夜或37℃ 1h；甩掉孔内封闭液，逐孔加满pH 7.4，0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min,甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干；    （3）加待检样品，每孔加入待检的疑似胞内分枝杆菌检样每孔100μL，37℃温育1~1.5h；弃去菌样，逐孔加满pH 7.4，0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min,甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干；每次检测应同时设定空白对照、阳性对照和阴性对照各孔；（4）加酶标抗体，每孔加入l : 5000~l : 3000稀释的辣根过氧化物酶标记的胞内分枝杆菌抗兔血清每孔100μL，轻轻摇匀，37℃温育1 h，弃去酶标抗体，逐孔加满pH 7.4，0.15mol/L PBS的洗涤缓冲液，静置2~3min,甩掉孔内洗涤缓冲液，反复洗涤2~4次后拍干；（5）加显色液，每孔各加入四甲基联苯胺TMB显色液100μL，，室温避光显色10min~30min；（6）终止反应，每孔加入2mol/L H₂SO₄50μL终止液终止， 测OD₄₅₀值，并记录；（7）判定结果，试验组OD₄₅₀/阴性对照组OD₄₅₀值大于或等于2.1为阳性；样品处理如检样为液体，取100μL检样进行ELISA检测即可；如检样为固体动物组织样品，将样品用高压灭菌的生理盐水冲洗三次，去除结缔组织，修切成0.5cm×0.5cm大小方块，加入约1mL生理盐水剪碎或研磨至匀浆；浸泡超过10min，离心取100μL上清进行ELISA检测。