[发明专利]一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法

摘要

本发明涉及一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法；是根据葡萄根瘤蚜ITS2序列设计特异性引物，以根瘤蚜基因组DNA为模板进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，如果扩增产物大小为114bp核酸序列，即说明样品含有根瘤蚜；进一步对含有根瘤蚜的样品进行实时荧光定量PCR分析，根据样品孔循环数与荧光强度之间的关系图可以直观的进行根瘤蚜含量的定性和定量。本发明首次将PCR技术用于葡萄苗木根部根瘤蚜的鉴定，解决了苗木检疫检验的困难，而实时荧光定量PCR技术有助于检疫部门对发生样品进行进一步定性定量，掌握和判断根瘤蚜传播和爆发的风险，具有灵敏度高、准确性大、操作简便、风险性小的好处。

主权项

一种利用PCR技术检测葡萄苗木中葡萄根瘤蚜的方法，其特征在于包括以下步骤：1)根据葡萄根瘤蚜ITS2序列设计特异性引物：上游引物：5’‑3’AATCCGCAGGTTATACGAACATC SEQ.ID.NO 1下游引物：5’‑3’CGGTCTCGTCAAATTTCGGA    SEQ.ID.NO 22)提取基因组DNA提取待检测样品DNA；3)根瘤蚜特异DNA片段扩增：使用步骤2)所述待检测样品DNA进行PCR扩增；PCR扩增体系25μl:10倍的buffer 2.5μl，2.5mM dNTP 2μl，上下游引物(10mM)各0.5μl，模板DNA1μl，taq酶1U，用无菌水补齐；反应程序：95℃预变性5min，95℃变性30s,56℃退火30s，72℃延伸30s，进行32‑35个循环反应；将PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳检测，凝胶成像系统下观察目的条带，若待检测样品扩增产物中含有114bp片段，则该待检测样品含有根瘤蚜；4)实时荧光定量PCR检测根瘤蚜将上述含有根瘤蚜的待检测样品DNA进行荧光定量PCR扩增；使用SYBR染料法，总反应体系为20μl：2×Ultra SYBR Mixture(With ROX)10μl，所述上、下游引物各0.5μl，模板为2μl，RNase‑Free Water 7μl；反应程序采取两步法PCR：95℃预变性10min；95℃变性10s,60℃退火/延伸1min，进行40个循环反应，建立荧光定量PCR扩增曲线图，根据每个样品孔的荧光强度曲线变化判断根瘤蚜及其含量。