[发明专利]一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法

摘要

本发明涉及一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其包括以下步骤(1)将受试细胞用可溶性重金属溶液处理；(2)将处理过的受试细胞固定并进行细胞透化；(3)将透化过的受试细胞染色；(4)用高内涵成像系统进行检测并分析。本发明的测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法操作方便、灵敏度高、检测速度快，并且具有明确的针对性，对重金属的遗传毒性研究进行了补充和扩展。

主权项

一种测定可溶性重金属致细胞DNA损伤的评价方法，其特征在于，该方法包括以下具体步骤：(1)设置重金属测试浓度：选取受试细胞，并测定目标可溶性重金属对该受试细胞的半抑制浓度IC50；根据得到的所述半抑制浓度IC50值设置4个可溶性重金属浓度梯度，分别为IC50，1/2IC50，1/4IC50,1/8IC50；另外设置一个空白对照；(2)细胞培养：传代培养所述受试细胞，待所述受试细胞达到80％融合率时用质量浓度为0.25％的胰蛋白酶将细胞消化，接种于96孔板，接种密度为0.5‑1×105个细胞/ml，置于37℃、CO2体积浓度为5％的CO2培养箱中培养24h；(3)可溶性重金属处理细胞：用步骤(1)中设置的重金属浓度梯度处理处于对数生长期的受试细胞培养物，置于37℃、CO2体积浓度为5％的CO2培养箱中继续培养24h；(4)细胞固定：将细胞从上述CO2培养箱中取出，用磷酸盐缓冲液洗涤96孔板上细胞，再用质量浓度4％的多聚甲醛溶液固定细胞15min，再用磷酸盐缓冲液洗涤2次以去除多余的多聚甲醛，每次洗涤时间不少于5min；(5)透化细胞膜：用含0.3％曲拉通‑100和1％的牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液处理固定细胞20min以使细胞膜通透，再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，每次洗涤时间不少于5min；(6)γH2AX染色：用10μg/ml异硫氰酸荧光素标记的γH2AX抗体对细胞进行染色，染色20min，再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次；(7)Hoechst染色：用含10μg/ml Hoechst的磷酸盐缓冲液染色20min；(8)图片获取：用高内涵成像系统对上述处理过的受试细胞进行检测，选择异硫氰酸荧光素和Hoechst荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；(9)图片分析：在图片扫描完成后使用高内涵分析软件进行分析，测量Hoechst通道细胞核的平均直径以设置单个细胞核的直径参数，根据细胞核之间的距离设置距离参数；根据以上设定软件对图片进行识别，并计算单个细胞核的异硫氰酸荧光素及Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值；用Hoechst通道的单个细胞核平均荧光值作为对照，比较FITC通道单个细胞核平均荧光值的变化，用其评价可溶性重金属的DNA损伤程度；(10)统计学分析：采用SPSS16.0软件进行分析，将试验组和对照组进行显著性t检验，以p<0.05作为显著性依据。