[发明专利]一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法有效
| 申请号： | 201510336445.1 | 申请日： | 2015-06-11 |
| 公开（公告）号： | CN104894222B | 公开（公告）日： | 2018-06-12 |
| 发明（设计）人： | 张琳;李朝辉;葛佳;董真真 | 申请（专利权）人： | 郑州大学 |
| 主分类号： | C12Q1/48 | 分类号： | C12Q1/48;C12Q1/44;C12Q1/68 |
| 代理公司： | 郑州立格知识产权代理有限公司 41126 | 代理人： | 田磊 |
| 地址： | 450000 河南省郑*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4多聚核苷酸激酶/磷酸酶及其抑制剂的新方法，它是通过以下步骤实现的：一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T碱基的序列；二、将上述探针用Tris‑HCl缓冲溶液稀释到浓度为100～1000nM，并把一定量T4 PNKP、Klenow Fragment、dNTPs与之混合，37℃反应40～150min；三、将上述反应液稀释为MOPS缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，室温下反应1～30min；四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，得到体系荧光强度与T4 PNKP浓度之间的对应关系，本发明方法操作简单、成本低、灵敏度高、选择性好，能够定量检测并筛选T4 PNKP及其抑制剂，为其他末端修饰酶检测方法的建立和分子生物学诊断提供了潜在的应用价值。 | ||
| 搜索关键词： | 荧光 抑制剂 多聚核苷酸 铜纳米颗粒 激酶 磷酸酶 检测 分子生物学诊断 反应液稀释 抗坏血酸钠 磷酸化修饰 定量检测 发夹探针 缓冲溶液 缓冲体系 末端修饰 灵敏度 硫酸铜 酶检测 潜在的 荧光仪 稀释 富含 探针 筛选 应用 | ||
【主权项】：
一种基于荧光铜纳米颗粒免标检测T4 多聚核苷酸激酶/ 磷酸酶的新方法，其特征在于：它是通过以下步骤实现的：步骤一、设计3′端磷酸化修饰的发夹探针，5′端为富含T 碱基的序列；步骤二、将上述探针用Tris‑HCl 缓冲溶液稀释到浓度为200 ～ 1000nM，并把一定量T4PNKP、Klenow Fragment、dNTPs 与之混合，37℃反应60～120min；步骤三、将上述反应液稀释为MOPS 缓冲体系，并加入硫酸铜、抗坏血酸钠，在室温下反应1～30min；步骤四、最终所得反应液用荧光仪检测其荧光强度，确定体系荧光强度与T4 PNKP浓度之间的对应关系；所述的设计探针5′端T碱基个数为大于等于20；所述的探针的浓度为200～1000nM；所述的Klenow Fragment 的用量为10～1000U/mL；所述的dNTPs 的用量为100～5000μM；所述的T4 PNKP 的用量为0～50U/mL；所述的抗坏血酸钠的用量为1mM～1μM；所述的硫酸铜的用量为50μM～20mM。
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