[发明专利]一种基于纳米粒子标记氧化还原循环检测多巴胺的方法

摘要

本发明属于电化学传感器领域，涉及一种基于纳米粒子标记氧化还原循环检测多巴胺的方法，利用金铂复合纳米粒子连接多巴胺适体互补序列单链DNA作为探针，再在探针中加入多巴胺适体，形成双链DNA修饰的金铂复合纳米粒子，当在双链DNA修饰的金铂复合纳米粒子溶液中加入含多巴胺样品溶液时，多巴胺和多巴胺适体特异性结合，探针被释放下来；然后，利用金纳米粒子和氧化石墨烯修饰的金电极捕获释放下来的探针，再利用金铂复合纳米粒子的催化作用产生电化学信号实现多巴胺的检测。本发明方法具有简单、灵敏度高的优势。

主权项

一种基于纳米粒子标记氧化还原循环检测多巴胺的方法，其特征在于利用金铂复合纳米粒子连接多巴胺适体互补序列单链DNA作为探针，再在探针中加入多巴胺适体，形成双链DNA修饰的金铂复合纳米粒子，当在双链DNA修饰的金铂复合纳米粒子溶液中加入含多巴胺样品溶液时，多巴胺和多巴胺适体特异性结合，探针被释放下来；然后，利用金纳米粒子和氧化石墨烯修饰的金电极捕获释放下来的探针，再利用金铂复合纳米粒子的催化作用产生电化学信号实现多巴胺的检测，测定步骤如下：(1)纳米粒子的制备：a、将氯铂酸溶液和柠檬酸钠溶液用0.22μm微孔膜过滤；b、金纳米粒子的制备：将质量分数为1.0％的柠檬酸钠溶液1.0mL快速加入到沸腾的浓度为0.3mmol/L的100.0mL的氯金酸溶液中，在溶液保持沸腾状态下搅拌10min，当溶液变成酒红色时，停止加热，冷却至室温，得金纳米粒子；c、金铂复合纳米粒子的制备：首先，将浓度为0.03mol/L的1.0mL的氯金酸溶液、0.1g的PVP和制备的10mL的金纳米粒子溶液置于盛放有50mL水的烧杯中，并混合均匀，然后将其转移到一个250mL烧瓶中加热；将混合溶液加热到沸腾并且保持沸腾状态10min后，在搅拌加热的同时加入7.0mL质量分数为1.0％的氯铂酸溶液，随后再缓慢加入一定体积的抗坏血酸溶液，等到溶液变成黑棕色后停止加热；然后再持续搅拌下将溶液冷却至室温，得金铂复合纳米粒子；将1mL制备的金铂复合纳米粒子在14000转/分钟的条件下离心10min，并用磷酸缓冲溶液洗涤三次，并分散于磷酸缓冲溶液中；(2)氧化石墨烯的制备：首先，取质量分数为98％的浓硫酸11.5mL置于锥形瓶中，然后放于4℃的条件下冷却1h；将处理过的含有冷却浓硫酸的锥形瓶放于冰水浴中，在磁力搅拌下，快速加入研磨处理过的含0.5g石墨粉和0.25g硝酸钠的混合物；反应5min后，分6次将共计1.5g的高锰酸钾加入溶液中，在控制反应温度在30‑45℃的条件下，搅拌反应2.5h，溶液变成墨绿色；然后将温度控制在80‑100℃之间，然后用滴液漏斗加入5mL去离子水，再继续反应30min；随后用滴液漏斗将质量分数为5％的10mL双氧水缓慢加入，继续搅拌1h，溶液逐渐变成土黄色，再将溶液转移到蒸发皿中在烘箱中烘干，然后再用去离子水将所得的固体溶解，将制得的氧化石墨烯放于透析膜中进行透析，直到氧化石墨烯溶液呈中性为止，并烘干；(3)DNA修饰纳米粒子的制备：将20μL的pH 8.2的50mmol/L的Tris‑HCl、10μL的10mol/L的TCEP、10μL的1.0×10‑4mol/L的巯基乙胺以及20μL的1.0×10‑6mol/L的DNA1加入到2mL的离心管中，使用振动器使所得的溶液充分混合，然后放于摇床中，在37℃条件下反应一个小时；然后加入洗涤过的金铂复合纳米粒子，并且在37℃条件下在摇床上孵育16h；随后，将溶液离心并用pH 7.4的1.0mL的0.1mol/L磷酸缓冲溶液冲洗三次，得DNA1修饰金铂复合纳米粒子探针；然后加入1.0×10‑6mol/L DNA2，在37℃条件下在摇床上孵育2h后离心分离，并用pH7.4的1.0mL的0.1mol/L磷酸缓冲溶液冲洗三次，并分散于1.0mL磷酸缓冲溶液中，得DNA修饰纳米粒子，储放于4℃条件下；(4)分析测定：首先，将金电极表面经过打磨处理，依次滴加上10μL的金纳米粒子、10μL氧化石墨烯，制得金纳米粒子和氧化石墨烯修饰的金电极；将100μL含多巴胺的样品溶液加入100μL的DNA修饰纳米粒子溶液中，37℃条件下反应0.5h后，离心分离，并在37℃条件下在摇床上孵育16h，并分散于50μL磷酸缓冲溶液中，得多巴胺作用后的金铂复合纳米粒子探针；随后将金纳米粒子和氧化石墨烯修饰的金电极插入反应0.5h后，用pH 7.4的1.0mL的0.1mol/L磷酸缓冲溶液冲洗电极表面三次，将所得的电极作为工作电极，将其插入2mL含有0.1～20mM对硝基苯酚，0.1～20NaBH4和0.1～20mM的二茂铁甲酸的pH 7.4的磷酸缓冲溶液中，采用三电极系统测定电化学信号；根据电化学响应信号与多巴胺的含量的关系实现多巴胺的测定。