[发明专利]芽胞杆菌一锅法分子育种方法及其应用

摘要

本发明涉及一种芽胞杆菌一锅法分子育种技术及其应用，该方法利用酵母体内重组系统，不需要额外的连接酶即可将几个DNA片段连接在一起形成环状。这些DNA片段需要经过特异的引物，利用PCR技术扩增而成。功能可分为靶基因片段、复制因子片段及筛选标记等，以便于在几个不同的宿主中复制繁殖。该方法可以一次性获得靶基因的多个拷贝数或者同时将几个不同的功能区域进行排列组合，使重组菌获得多功能性。此方法快速可靠，操作简单，节约成本，重复性好，尤其适合于实验室内的芽胞杆菌分子育种工作，对于快速的改造目标菌株，使其获得优良性状具有重要的指导意义及应用价值。

主权项

芽胞杆菌一锅法分子育种方法，包括：特异引物的设计每条引物数量在50‑60个碱基，正义链引物起始序列需要为上游片段的尾端序列35‑40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身前端序列20‑25个碱基；反义链引物序列为下游片段的前端序列35‑40个碱基，剩余的碱基数为目的片段自身尾端序列约为20‑25个碱基，每条引物间保持G+C%值相等或相差不超过5℃；PCR反应根据设计好的引物，分别扩增每个功能片段；各片段的纯化酵母菌的转化与重组子的筛选将PCR片段混合物进行酵母菌的电转化，并通过双抗平板进行重组子的筛选；芽胞杆菌的转化与重组子的筛选与鉴定。