[发明专利]一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法

摘要

本发明提供一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法。首先，基于诱导型启动子O_RO_lac和强启动子ermEp^*，首次在链霉菌中构建了梯度诱导表达体系。其次，通过梯度诱导控制靶基因表达量，偶联分析靶基因表达量与目标药物产量的关系，从而揭示药物生物合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性。最后，通过组成型启动子ermEp^*，理性串联高表达相关限速酶编码基因，获得了一株恰塔努加链霉菌高产菌株L12，送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号：CGMCC No.10157。摇瓶发酵结果显示L12中纳他霉素产量是恰塔努加链霉菌L10的3.3倍。50L发酵罐小试中，最高产量达到15.7 g/L。本发明方法高效、准确、操作简单，且普遍适用于其它链霉菌。

主权项

1.一种链霉菌药物高效生物合成的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1) 将报告基因egfp分别置于强启动子和阻遏蛋白控制的诱导型启动子后，构建梯度表达载体，分别通过结合转导整合至宿主链霉菌恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis)L10基因组中；所述的诱导型启动子为OROlac，由SEQ ID NO：1 的核苷酸序列组成；强启动子为组成型启动子ermEp*，由SEQ ID NO：2 的核苷酸序列组成；所述恰塔努加链霉菌L10由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，分类命名：恰塔努加链霉菌，保藏号：CGMCC No.2644，保藏日期：2008年8月27日，保藏地址：北京市朝阳西路北展西路1号院3号中国科学院微生物研究所； (2) 无菌条件下，将步骤（1）处理的恰塔努加链霉菌L10接种于斜面培养基中，置于培养箱中培养，所述斜面培养基为：酵母提取物 4.0g/L，麦芽提取物 10.0 g/L，葡萄糖 4.0 g/L，琼脂糖 20.0 g/L，其余为水，pH 值调至6.0；(3) 斜面培养后，将培养好的孢子块接入盛有摇瓶种子培养基的三角瓶中，摇床培养18‑22小时，所述种子培养基为：葡萄糖 17.5g/L，蛋白胨15 g/L，NaCl 10 g/L，其余为水，pH自然；(4) 将步骤(3)所得的种子液转接至4%YEME培养基中， 12小时后加入诱导剂，继续摇瓶培养至48小时，所述4%YEME培养基为酵母提取物3.0g/L，麦芽提取物 3.0 g/L，蛋白胨 5.0 g/L，葡萄糖 40 g/L，其余为水，pH自然；(5) 吸取步骤(4)所得的链霉菌菌液，离心收集菌体，采用PBS缓冲液清洗菌体一次，加入蛋白裂解缓冲液和蛋白水解酶抑制剂，超声破碎细胞，4 °C、12000 r/min离心10 min，转移上清至新的1.5 ml离心管中，对蛋白进行定量后，取蛋白样品分别进行SDS‑PAGE和Western blotting检测，与此同时，取少量液体培养的链霉菌菌液，通过激光共聚焦显微镜观察绿色荧光强度；蛋白裂解缓冲液：PH 8.0的Tris HCl 50mM，NaCl 150mM，EDTA 5mM，Glycerol5%，Triton X‑100 1%；蛋白水解酶抑制剂：PMSF；(6) 分析不同诱导条件下和不同启动子活性下eGFP 的表达变化曲线，初步建立链霉菌梯度诱导表达体系；(7) 将四个限速酶编码基因：scnK、scnJ、scnC和scnD分别置于诱导型启动子和强启动子后，构建梯度表达载体，分别通过结合转导导入对应的靶基因缺失菌株中，构建突变菌株；所述四个限速酶编码基因：scnK、scnJ、scnC和scnD由SEQ ID NO：5‑8 的核苷酸序列组成，其中scnK、scnJ和scnC依次置于强启动子ermEp*后，scnD单独置于强启动子ermEp*后，通过两套整合酶体系整合至恰塔努加链霉菌L10的基因组中；(8) 偶联分析目的药物和靶基因的表达量的对应关系，揭示纳他霉素合成途径中的限速反应及其限速酶的适配性；(9) 将限速酶基因分别置于强启动子ermEp*后，构建载体，通过结合转导导入恰塔努加链霉菌L10中，获得恰塔努加链霉菌(Streptomyces chattanoogensis) L12；所述恰塔努加链霉菌株L12已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏号：CGMCC No.10157，分类命名：恰塔努加链霉菌，保藏日期：2014年12月11日，保藏地址：北京市朝阳西路北展西路1号院3号中国科学院微生物研究所；(10) 将恰塔努加链霉菌L12接种于种子培养基中，摇瓶培养18‑22小时后转接入新鲜的种子培养基中，形成二级种子液，其中的种子培养基同步骤（3）；(11) 将步骤(10)中的二级种子液转接至发酵罐培养基中，控制发酵罐的各个参数，在不同的发酵时间点取样；发酵罐培养基：大豆蛋白粉20 g/L，酵母粉8 g/L，葡萄糖40 g/L，其余为水, pH自然；(12) 使用甲醇浸提发酵培养液中的纳他霉素，通过高效液相色谱检测其产量。