[发明专利]李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法及检测

摘要

本发明公开了一种李痘病毒主要株系杂交探针及基因芯片的制备方法，所述探针包括：PPV‑D；PPV‑M；PPV‑EA；PPV‑Rec；PPV‑W；PPV‑C。一种基因芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：制备基因芯片点样；PCR扩增与样品标记；芯片预处理；芯片的杂交；芯片的清洗；芯片的扫描分析；数据处理与结果判定。本发明的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种用于检测李痘病毒主要株系杂交探针；本发明还涉及一种包括上述探针的基因芯片的制备方法。

主权项

1.一种采用基因芯片检测李痘病毒的方法，其特征在于包括以下步骤：A、制备基因芯片点样：取5μl纯化探针，加点样液5μl混匀，探针浓度为10μM；加到点样仪，将寡核苷酸探针点在醛基玻片上，并通过探针5’末端的氨基基团进行共价固定；其中所述探针为：PPV‑D：5’‑ CAACAAAACCAGTTTCACAGGTGCCAGGACCTCAACTGCAA‑3’PPV‑M：5’‑ CGGTAAGACCAGTTCCTCCAATTTCAGGGACCAAACCGCGG‑3’PPV‑EA：5’‑ CCACTAGGACAGTGCCTCACACAACAACTACTACACCTCCT‑3’PPV‑Rec：5’‑ CGATAAGACCAGTTTCTCCAATTTCAGGGGCCACACCGCAG‑3’PPV‑W：5’‑ GCGTGAAGCCAACTACATCAGCAACAATTAACCCAACGTCT‑3’PPV‑C：5’‑ ATGTGAGACCGATTGCACCAGTAGTGACAAGTCCATTCTCG‑3’；B、PCR 扩增与样品标记：B1、感病植物总RNA 提取：称取0.1g 感病植物组织样品，然后按照Trizol试剂盒方法提取样品总RNA；B2、反转录：在装有去离子水9.5μL 的0.2mL PCR 管中，加入B1 中提取的样品总RNA 2μL，Oligo(dT)15 0.5μL，dNTPs 1μl ，混合均匀，70℃ 水浴 5min 后立即置于冰上2min，3000rpm 离心30 秒后加入5×cDNA第一链合成缓冲液4μL，0.1mol/L DTT 1μL，RNase抑制剂 1μL，M‑MLV反转录酶1μL，40℃水浴60min；B3、 PCR 扩增：在0.2mL PCR 管中，加入10×PCR 扩增缓冲液2.5μL， dNTPs 1μL，Cy3 标记的PPV‑chip‑P1 1μmol/L，Cy3 标记的PPV‑chip‑P2 1μmol/L，反转录合成反应液2μL，加水至25μL，Taq聚合酶 0.5μL；94℃ 3 分钟；94℃ 40s，55℃ 40s，72℃ 1min，循环35 次；72℃ 10min；4℃保存；C、芯片预处理：点样仪中干燥好芯片于65℃烘箱中固定1h，将芯片点有DNA 的一面在60℃水浴锅上水合10s，芯片距水面距离2‑3cm，在空气中室温自然干燥后，再进行一次水合，之后将点有探针的一面朝上，放在紫外交联仪中250mJ 交联，后再将芯片放在42℃预热的0.5% SDS 中洗涤10min，再用42℃预热的蒸馏水清洗4min，最后用无水乙醇清洗2min，2000rpm 离心5min 去除芯片表面的液体后，密封，室温保存备用；D、芯片的杂交：制备好芯片放置在杂交盒中，将标记样品与杂交液的混合物混匀后，3000rpm，离心30s，于95℃沸水中变性处理3min，冰浴骤冷1min，然后用移液器将杂交混合液分别加注到杂交芯片的盖片上的小孔中，使预杂交液覆盖于点样区，然后盖紧杂交盒的盖，放入42℃的水浴中，杂交2h，使样品与探针充分混合；E、芯片的清洗：杂交结束后，在暗室内取出芯片，杂交面朝上放于清洗盒中，放在水平摇床上用42℃预热洗液1 清洗4min，以便洗去没有与探针特异性结合的样品；然后迅速地用镊子将芯片转移到盛放有洗液2 的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上用42℃预热洗液2 清洗4min，清洗结束后，1500rpm，1min 离心干燥，除去玻璃表面上的液体；F、芯片的扫描分析：步骤E 清洗完毕4 小时内进行扫描，利用基因芯片激光共聚焦扫描仪扫读芯片信息；G、数据处理与结果判定：扫描后图像将通过判读软件自动进行分析，通过比较分析信号中位值和信号平均值的输出数据，以其中最能反映芯片杂交图像信息的参数值进行结果分析，当芯片上呈现绿色信号且HEX 质控信号呈现绿色信号时即可判定阳性反应，对于反应强烈的直接从扫描图片上荧光的反应判断检测结果；其中步骤D 中配制的杂交混合液包括100%甲酰胺 5μl ，10% SDS 0.2μl ，20 X SSC 1.5μl ，PCR 样品标记物3.3μl，共10μl；步骤F 中利用基因芯片激光共聚焦扫描仪扫读芯片信息的具体步骤：先打开扫描软件，然后开仓，将芯片插入机器内，关仓，使用绿色荧光通道，先使用4 伪彩进行预扫一次，以便选择扫描区域，再进行精扫，扫描参数为扫描分辩率为10μm，激发光源波长532nm，接收的荧光信号中心波长570nm，检测灵敏度小于一个荧光分子/μm2，激光功率值Laser Power 100%，光电倍增管效率值PMT Gain 600；步骤B3 中所述PPV‑chip‑P1 的序列为：5’‑ CCCATTTTCACRCCAGCARC ‑3’ Tm=61.8；其中R 表示碱基G 或者A；所述PPV‑chip‑P2 的序列为：5’‑ TCGCATGATCCAACAATGGC ‑3’ Tm=59.8 。