[发明专利]一种基于气压计检测凝血酶的方法

摘要

本发明涉及一种基于气压计检测凝血酶的方法，属于分析化学领域。首先在凝血酶的适配体A上修饰过氧化氢酶，再将凝血酶的另一段适配体B修饰在磁珠上，以这两段适配体为捕获识别探针。当存在凝血酶的时候，能形成磁珠/适配体B–凝血酶–适配体A/CAT的三明治结构的聚合物，该聚合物能够受磁场的作用进行迁移富集，使其便于分离纯化；而CAT能够催化过氧化氢溶液分解产生氧气，能引起密闭环境中气压的变化，从而适合于气压计的检测使用。该方法用价格低廉的气压计代替传统的分析检测工具为检测手段；利用凝血酶适配体对目标物凝血酶的特异性高效识别捕获，建立一种检测成本低、操作简单、定量结果准确、能即时快速检测的凝血酶的新方法。

主权项

一种基于气压计检测凝血酶的方法，其特征是：（1）已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程的建立①采用过氧化氢酶修饰凝血酶的一段DNA适配体A，得到最终浓度为0.3μMCAT‑DNA适配体A溶液；②将修饰有链霉亲和素的磁珠加入含有0.1MNaCl和0.05%Tween‑20的0.1MpH=7.3的PBS缓冲液中，再加入经生物素修饰的凝血酶的一段DNA适配体B，室温振荡30分钟，洗涤定容，得到最终浓度为0.3μM，修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液；③将步骤①制备的CAT‑DNA适配体A溶液与修饰在磁珠上的DNA适配体B溶液按等体积的比例混合，加入含有已知浓度的凝血酶的待测溶液，室温培育1.5～2个小时，由于步骤②中加入经生物素修饰的凝血酶的一段DNA适配体B对凝血酶的特异性识别并结合，形成“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”样品聚合物；④利用磁铁对步骤③中得到的样品聚合物进行分离纯化，即用含有0.1MNaCl和0.05%Tween‑20的PBS缓冲液对样品聚合物进行洗涤，而后将经洗涤的样品聚合物装入样品杯，样品杯靠近磁铁，使溶液中的“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”聚合物聚集于样品杯杯壁，如此反复3‑5次，即得到经过纯化的“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”聚合物；⑤将上述步骤得到经过纯化的“DNA适配体B‑凝血酶‑CAT‑DNA适配体A”聚合物加入自制的反应器中与过氧化氢溶液反应，用气压计检测反应器中压力值；⑥采用上述①～⑤相同的步骤，对另一已知浓度的凝血酶溶液进行处理；如此重复，得到一系列已知浓度的凝血酶溶液对应的反应后的气体压力值；⑦以已知浓度的凝血酶溶液浓度（x）为横坐标点，对应的气压值（y）为纵坐标点，建立直角坐标系；将相邻坐标点（x，y）连接，建立已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程：y=kx+b，其中y为气压值，x为凝血酶浓度；（2）待测凝血酶样品的预处理和气压值的获得采用“已知浓度的凝血酶浓度与压力线性方程”中①～⑥相同的步骤，对未知浓度的凝血酶溶液进行处理，得到对应的气体压力值；（3）待测凝血酶样品浓度的获得根据线性方程：y=kx+b，将通过“待测凝血酶样品的预处理和气压值的获得”中得到的待测样品的气压计值代入方程，计算得到待测凝血酶样品的浓度；所述的修饰有生物素的凝血酶DNA适配体B的序列为从左到右5’到3’：生物素‑CCCCCACGTTGTAAAACGACGGCCAGT；所述步骤（1）中所述的自制反应器反应器为一个广口玻璃瓶，以带有两根导管的橡胶塞为密闭盖，其中一根导管与精密型的气压计相连，另一根则装有阀门，阀门打开时能使反应器与大气连通；首先在广口玻璃瓶注入过氧化氢溶液，而后将装有样品聚合物的样品杯垂直放入广口瓶内的侧壁，并利用广口玻璃瓶外的磁铁吸力，保持样品杯处于竖立状态；关闭阀门，此时气压表上的显示数值为0.00KPa；移去磁铁，则样品杯倾倒，小管中样品聚合物与过氧化氢溶液接触，反应促发，释放出气体，反应器中气压增大；待气压表显示的数值稳定后，记录数据，即得到该样品聚合物所对应的气压值；所述的修饰有过氧化氢酶的凝血酶DNA适配体A的序列为从左到右5’到3’：HS ‑TTTTTTTTTTGGTTGGTGTGGTTGG。