[发明专利]一种利用双重PCR技术检测Cf-9和 I-2基因的方法

摘要

本发明公开了一种利用双重PCR技术检测Cf-9和 I-2基因的方法。包括番茄植株叶片DNA 提取、双重PCR所用引物、单管PCR扩增、双重PCR扩增体系等步骤。就是在一个反应体系中对I-2和Cf-9标记进行多重PCR 标记。应用不同的分子标记对抗病基因进行辅助选择，利用该体系可在同一管中同时扩增出Cf-D1/D2和I-2/5F/R两对基因，大大节省了时间和检测成本，为番茄的抗病育种提供了切实可行的分子标记检测方法。

主权项

一种利用双重PCR技术检测Cf‑9和 I‑2基因的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）DNA 提取：取番茄植株的叶片，提取总DNA；（2）引物的设计与合成：双重PCR所用引物：引物             引物序列(5’‑3’)               Cf‑D1          GTTCTTATCCTTTAACACCCACf‑D2         TCC CTCCAA ATTATTACTTCCI‑2/5F         CAAGGAACTGCGTCTGTCTG‑3′I‑2/5R       ATGAGCAATTTGTGGCCAGT‑3′（3）单管PCR扩增PCR总体积为25μL，其中包括10×反应缓冲液（含Mg^2＋）2.5μL，dNTP混合物（2.5mmol/L） 0.5μL，上游引物（10μmol/L） 2.5μL，下游引物（10μmol/L）2.5μL，模板 DNA 0.5‑2μL，DNA聚合酶（5 U/μL ）0.5μL，其余用水补足；反应程序:94 ℃变性2 min ;94 ℃30 s ，58 ℃30 s ，72 ℃1. 5 min ，35个循环;72 ℃延伸10 min；（4）双重PCR扩增：各体系引物配比体系名称   引物            体积配比（10μM）μL体系1     Cf:I2               2：2体系2     Cf:I2               2：1.5体系3     Cf:I2               2：1体系4     Cf:I2               2：0.5；PCR 反应其它参数采用以下体系进行扩增：模板 DNA2μl，dNTP1μl，10×Buffer 2.5μl，Taq 酶 0.5μl， 加 ddH2O 至20μl；扩增含有抗病基因的PCR 反应程序为 94℃变性 5min；然后 94℃，30sec、57℃，1min、72℃，2min 30sec，进行 30 个循环；最后 72℃延伸 10min，4℃保温，扩增产物在 ‑20℃保存；（5）双重PCR扩增体系：实验对Cf‑D1/D2和I‑2/5F/R两对引物进行了引物配比，最终确定体系为：模板 DNA2μl，dNTP1μl，10×Buffer 2.5μl，Taq 酶 0.5μl，引物浓度分别为Cf‑D1/D2（10μM）为2μl，I‑2/5F/R（10μM）为0.5μl, 加 ddH₂O 至20μl，扩增PCR 反应程序为： 94℃变性 5min；然后 94℃，30sec、57℃，1min、72℃，2min 30sec，进行 30 个循环；最后 72℃延伸 10min，4℃保温。