[发明专利]酿酒酵母分泌表达plantaricinA抑制植物乳杆菌的方法

摘要

酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法利用基因工程改造酿酒酵母，使之分泌植物乳杆菌素plantaricinA(PlnA)，从而抑制酿酒酵母乙醇发酵中植物乳杆菌染菌的方法，属于生物领域。酿酒酵母发酵生产生物乙醇属于生物化工领域。生物乙醇工业规模的生产常常受到乳酸菌污染的影响，其中植物乳杆菌对其危害最大。本发明旨在构建酿酒酵母工程菌，使其分泌表达植物乳杆菌素PlnA，从而对乳酸菌污染进行防控。本发明的工程菌InvScI‑plnA长势较好，且可成功分泌PlnA，浓度约为(20μg/ml)，其培养上清液加入乳酸菌培养体系后，测量乳酸菌的生物量的变化，证明其对植物乳杆菌具有明显的抑菌效果。与现有的抗生素法相比，PlnA环境友好、对人体无害，具有较高的潜在商业价值和应用潜力。

主权项

通过酿酒酵母分泌表达plantaricin A抑制植物乳杆菌的方法，其特征在于：选用酿酒酵母(Saccharomyces cerevistae)InvScI菌株作为宿主菌；植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ATCC BAA‑793作为植物乳杆菌素产生菌，具体操作如下：(1)将Lactobacillus plantarum ATCC BAA‑793接种于MRS培养基置于30～37℃恒温箱培养过夜，进行菌种复苏；将复苏后的菌液接种于MRS培养基，置于30～37℃恒温箱培养12～16h，离心收集菌体；使用细菌全基因组提取试剂盒获取Lactobacillus plantarumATCC BAA‑793全基因组；(2)按照plnA序列SEQ ID No.1设计plnA序列上游引物SEQ ID No.2和plnA序列下游引物SEQ ID No.3；根据Taq酶说明书设计程序进行PCR，扩增目的片段；利用T4连接酶将PCR产物与载体PMD‑19T‑Simple连接，转化进入大肠杆菌Top10中；(3)通过对载体和片段酶切位点分析，选定酶切位点KpnI和NotI，设计α‑factor的上游引物搭桥SEQ ID No.5、下游引物搭桥SEQ ID No.6、plnA的上游引物搭桥SEQ ID No.7和下游引物搭桥SEQ ID No.8，α‑factor的下游搭桥引物SEQ ID No.6与plnA的上游搭桥引物SEQ ID No.7序列反向互补；通过搭桥PCR在plnA上游加上分泌信号肽α‑factor，形成片段α‑factor‑plnA；使用KpnI和NotI对片段α‑factor‑plnA和质粒pYES2.0进行双酶切；使用T4连接酶将酶切后的片段与质粒连接形成质粒pYES2.0‑plnA；将连接产物转化进入大肠杆菌Top10中；(4)利用质粒小提试剂盒提取质粒pYES2.0‑plnA，并通过醋酸锂转化进入酿酒酵母InvScI，利用尿嘧啶营养缺陷培养基筛选阳性克隆；(5)取步骤(4)筛选所得的阳性克隆菌种接入尿嘧啶缺陷培养基，于30～35℃，180～220rmp条件下过夜培养，进行菌种活化；其中，尿嘧啶缺陷培养基配方，1L培养基含有YNB6.7g，葡萄糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL；其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L；葡萄糖要单独灭菌；(6)按照OD600＝0.4～0.6，将活化后的菌液接入50mL以半乳糖为唯一碳源的诱导培养基，培养36h，离心收集上清液；所用半乳糖诱导培养基，1L培养基含有YNB 6.7g，半乳糖20.0g，氨基酸混合培养液，10.0mL；其中氨基酸混合培养液配方为：亮氨酸10.0g/L；色氨酸10.0g/L；组氨酸5.0g/L；半乳糖要单独灭菌。