[发明专利]小鹅瘟灭活疫苗的制备方法及其制备的灭活疫苗

摘要

本发明涉及一种小鹅瘟灭活疫苗的生产方法，属于生物制品技术领域，所述方法包括：1)健康易感鹅胚的筛选，2)生产用毒液的制备，3)毒液效价的测定、灭活、配苗及分装。本发明制备的小鹅瘟灭活疫苗通过免疫种鹅，使种鹅在产蛋期内血清、种蛋卵黄小鹅瘟病毒特异性抗体处于较高水平，所孵化雏鹅出雏后既能通过吸收卵黄产生良好的被动免疫保护效果。本疫苗具有安全性高、可多次免疫、显著降低人力成本且不存在散毒的危害性等优点。

主权项

1.一种小鹅瘟灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1)筛选健康易感鹅胚筛选11日龄易感鹅胚，通过对非免疫鹅胚卵黄中GPV琼扩抗体和/或接种前鹅胚内小鹅瘟病毒的检测来确保非免疫鹅胚的质量，主要步骤包括小鹅瘟琼脂扩散试验抗原制造及质量标准、小鹅瘟琼脂扩散抗体的检测和小鹅瘟病毒抗原检测方法，并同时按照2010版的《中国兽药典》附录中关于外源毒检测的方法进行检测；2)生产用毒液的制备毒种繁殖将种毒稀释，接种于11日龄易感鹅胚的尿囊腔内，接种后每日照胚3～4次，选取48～120小时内死亡且病变明显的鹅胚，收获无菌且对1％鸡红细胞悬浮液凝集阴性的尿囊液样品；接种将上述尿囊液样品稀释，接种于11日龄易感鹅胚的尿囊腔，继续孵育，每日照蛋1次，将48小时内死亡的鹅胚弃去，然后每4～6小时照胚1次，随时取出48～144小时死亡的鹅胚，置于2～8℃冷藏库冷却4小时以上，弃去144小时以后的活鹅胚；收获将上述冷却的鹅胚取出，吸取尿囊液清亮的绒毛尿囊膜及羊膜的胚液，吸取胚液放于灭菌容器中，分别取样，‑20℃以下保存备用；同时挑取胚体于另一灭菌容器中，胚体用组织捣碎机8000～10000转/分、研磨10～20分钟，制成组织匀浆液，置于‑20℃冻融2次，用灭菌的4层纱布和1层80目铜网进行过滤，弃胚渣，将胚体组织滤液取样，‑20℃以下保存备用；纯化经检验合格的病毒液通过无菌管道传送至Alta Laval在线碟片式离心机，经连续在线离心后，在线离心速度为5000～8000转/分钟，获得纯化后的病毒液；浓缩病毒经纯化后通过无菌管道传送至PALL浓缩机进行浓缩，根据浓缩前病毒含量确定的浓缩倍数进行浓缩，使浓缩后病毒液中每毫升中病毒含量不低于10^8.0ELD₅₀；灭活将检验合格的抗原混合液用灭菌的4层纱布和1层80目铜网进行过滤，置灭活罐中，加入经0.2M NaOH环化的BEI，使其终浓度达到0.1％，边加边搅拌，充分混合，当灭活罐中心温度升至32℃后开始计时，以120转/分灭活60小时，灭活后以终浓度为2％的硫代硫酸钠进行终止，置2～8℃保存备用，应不超过3个月；成型取注射用白油94份，加硬脂酸铝1份，边加入边搅匀，直到完全透明为止，再加入6份司本‑80，混合后，高压灭菌备用；取灭活的制苗用病毒液96份，加入4份灭菌的吐温‑80，充分摇匀，直至吐温‑80完全溶解；取3份油相放入乳化罐中，慢速搅拌的同时缓缓加入1份水相，加完后，中速搅拌，然后经剪切机连续的高速低温乳化，温度设定为10～20℃之间，制成小鹅瘟灭活疫苗。