[发明专利]一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法

摘要

本发明涉及微生物免疫行业技术领域，具体涉及一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法。包括以下几个步骤：实时荧光定量PCR引物的合成；病毒RNA的提取；病毒RNA纯度的确定；病毒RNA反转录成cDNA；阳性标准品的制备；荧光定量PCR反应条件的建立。本发明能够定量分析样本中RNA的拷贝数，准确检测出样本中的基因数目，可对感染Vero E6细胞和感染实验小鼠两种不同样本中的汉城病毒核酸进行检测，使用范围大，对比性强，操作简便快速，且本发明对操作实验室环境要求不高，可实现样本的批量检测，节省了大量的时间和成本，检测特异性强，重复性好，结果真实可靠。

主权项

一种用于快速检测鉴定汉城病毒的方法，其特征在于包括以下几个步骤：1)实时荧光定量PCR引物的合成：根据SEOV SR‑11株的S基因序列，利用Olig06.0软件及NCBI Blast方法分析设计出上下游引物，分别命名为上游引物SEOV‑S‑F‑14和下游引物SEOV‑S‑R‑14，扩增片段长度为153bp；2)病毒RNA的提取：按常规方法培养Vero E6细胞成单层后，接种SEOV SR‑11，吸附2h后换成2％胎牛血清的维持液，并在CO₂培养箱内37℃条件下培养12d，提取细胞中的总RNA备用；接种SEOV SR‑11的昆明鼠乳鼠鼠脑，在接种病毒后的第1天至25天内，每3天取血清一次，并提取血清中的病毒RNA备用；3)病毒RNA纯度的确定：提取的病毒RNA溶于60μl经DEPC技术处理的ddH₂O，用微量分光光度计检测RNA标本在260nm和280nm波长下的光密度值OD260和OD280,通过计算OD260/OD280的比值，确定病毒RNA的纯度；4)病毒RNA反转录成cDNA：取10μl提取好的RNA，加入下游引物1μl，dNTPs 2μl，置65℃水浴5min，取出后冰裕2min，再依次加入5×First‑Strand Buffer 4μl，DTT 2μl，37℃水浴2min，加入M‑MLV 1μl，70℃水浴50min，最后置70℃条件下15min终止反应，存贮在‑20℃条件下备用；5)阳性标准品的制备：以上述步骤4)中的cDNA为模板，以S‑F：5‘‑ATGGCAACTATGGAGGAA‑3’为上游引物，S‑R：5‘‑TTAGAGTTTCAAAGGCTCT‑3’为下游引物进行PCR反应，回收目的DNA片段，将目的片段与pMD18‑T载体16℃连接过夜，转化DH5α感受态细胞，构建阳性标准品质粒，提取质粒并用紫外分光光度计测定浓度，并计算其拷贝数，贮存在‑20℃条件下备用；6)荧光定量PCR反应条件的建立：10倍梯度稀释质粒pMD18T‑S标准品进行Real‑time PCR扩增，反应条件为：95℃预变性10s，95℃变性5s，60℃退火/延伸20s，每个循环退火延伸结束时检测荧光信号，共40个循环，在PCR过程中由实时荧光定量PCR仪自动绘制线性标准曲线，反应结束后先加热至95℃，然后降至72℃，开始以0.2℃/s递增加热至95℃检测荧光信号得出扩增产物的熔解曲线，每次实验均设立1个空白对照，当空白对照为阴性时，实验有效，其中CT值＞30为阴性，CT值不超过30为阳性。