[发明专利]一种提取胎盘多种干细胞的方法

摘要

本发明涉及干细胞及组织工程领域，特别是一种提取胎盘多种干细胞的方法。针对现有胎盘多种干细胞提取中存在的问题与不足，本发明的目的是提供一种提取胎盘多种干细胞的方法,克服现有技术中存在的问题。其解决问题的技术方案是：一种提取胎盘多种干细胞的方法,由以下步骤组成：步骤一、胎盘收集前的处理：步骤二、胎盘的实验室处理：三、细胞处理阶段：步骤四、细胞进行质检：这个方法比较简单易行,不但可以得到胎盘干细胞，也可以通过消化等手段，从已经分离过胎盘干细胞的胎盘组织中，分离另外三种干细胞，即造血干细胞、间充质干细胞和内皮祖细胞。

主权项

1.一种提取胎盘多种干细胞的方法，由以下步骤组成：步骤一、胎盘收集前的处理：胎盘娩出后十五分钟，结扎脐带，吸取50ml胎盘抗凝液，装置静脉插管接头，缓慢向胎盘注射，有少量血液从动脉流出即可，立即用血管夹夹住脐带，位置是胎盘上5厘米，夹紧后，轻轻颠倒胎盘数次，检查胎盘完整性，并使液体混匀；将胎盘放入胎盘保存液中，置于运输箱，温度在20度；其中，胎盘抗凝液包括以下三种成分：（1）抗生素，青霉素、链霉素和两性霉素B，用量分别为 100U/ml，100ug/ml和 10ug/ml，（2）肝素：临床用肝素钠，终浓度为 50U/ml，（3）培养基：可用 IMDM，alpha‑MEM，每个胎盘注射量为 50ml±5 ml；胎盘保存液组成为：胎盘抗凝液，但是肝素用量减至 10U/ml，或用盐水或 PBS，加入抗生素和肝素；步骤二、胎盘的实验室处理：使用碘伏消毒脐带及胎盘表面；生理盐水充分冲洗残留脐带和胎盘，至少三次；将脐带置于相对高处，高度20cm‑30cm之间；打开血管夹，插入静脉导管和动脉导管，连接灌洗液瓶和细胞收集瓶及蠕动泵，进行第一次灌注，液体量在100ml‑200ml，大部分血液流出，流出的液体变浅，夹住静脉导管，挤压胎盘，使残存血液流出，此时收集的细胞主要是造血干细胞，按照上述操作，此时收集的造血干细胞量相当于一个脐血单位，打开静脉导管，夹住动脉导管，将干细胞动员剂灌入胎盘，用量不超过100ml，将动脉导管和静脉导管夹住，将导管放入胎盘处理盒，将盒子放入37度培养箱，静置2小时；取出，放入超净台，连接动静脉导管、灌洗液瓶和细胞收集瓶；缓慢灌装，当收集的液体透明，说明所有的细胞均已收集，灌洗液用量 500ml‑800ml，停止灌洗；其中，灌洗液的组成为：alpha‑MEM 基础培养基、抗生素、肝素，初次灌洗用量为 100‑200ml，后续用量在 500ml，一个胎盘用量 500‑1000ml；干细胞动员剂成分为：在灌洗液基础上加入趋化因子 SDF‑1alpha，终浓度为 50ng/ml，用量为一个胎盘100±5 ml；步骤三、细胞处理阶段：将收集的细胞悬液1L，离心速度为600g，10分钟，离心去除大量的液体，用alpha‑MEM悬浮细胞沉淀，利用3%醋酸计数有核细胞数；调整细胞浓度为1×107/ml，淋巴细胞分离液密度梯度离心收集单个核细胞，同时，去除细胞碎片，离心速度为800g，20分钟，离心洗涤；810g，10分钟；使用生理盐水离心洗涤，500g，10分钟；利用冻存液悬浮，冷冻；步骤四、细胞进行质检：流式细胞学分析：部分细胞表达 CD133 和 CD34 造血干细胞和内皮祖细胞标志物，PCR，可检测到胚胎干细胞特有标记 OCT‑4 表达。