[发明专利]一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法

摘要

一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化、菌丝DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS-rDNA基因、PCR目的片段的测序、序列的比对鉴定等步骤。本发明的特点和意义在于：建立并完善烟草内生真菌的分离、培养与鉴定体系，有助于提供烟草内生真菌与烟草之间相互作用关系及其生物功能的新信息，为系统剖析烟草内生菌的多样性与功能性提供理论依据。本发明的提出对于烟草内生真菌的研究及开发、阐明烟草内生真菌的种类、分布特点，提高烟叶品质具有重要意义。

主权项

一种快速分离、鉴定烟草内生真菌的方法，其特征在于：包括烟叶表面消毒、切片培养、菌丝的分离纯化、菌丝DNA的提取、PCR扩增真菌的ITS‑rDNA基因、PCR目的片段的测序、序列的比对鉴定，具体步骤如下：（1）用无菌水浸泡新鲜烟叶并洗涤，除去烟叶表面杂质；（2）将步骤1中处理烟叶用75%乙醇浸泡消毒2～3 min，并用无菌水洗涤2～3次除去乙醇；（3）检验步骤（2）中消毒是否彻底：取最后一次清洗烟叶上乙醇的无菌水，利用涂布法涂平板培养，看是否有杂菌长出，若有无杂菌长出则消毒彻底；若有杂菌长出，则消毒不彻底，需重复消毒；（4）将步骤（2）中烟叶去除叶片边缘，切成0.5×0.5 cm小块放入培养基中培养；（5）将步骤（4）中的烟叶与培养基放入培养箱，25℃恒温培养；（6）观察步骤（5）中烟草内生菌生长状态，待切口处长出菌丝后，将菌丝在新鲜培养基中利用平板划线法进一步纯化，连续分离3～5次即可得到表面形态一致的烟草内生真菌；（7）观察记录步骤（6）中获得的烟草内生真菌菌落形态，并对菌株编号，将一部分纯化的菌丝在无菌条件下利用接种针挑入已灭菌的20%甘油水溶液中，‑20℃保存留种；另一部分冷冻干燥后备用；（8）取 0.1 g步骤（7）中冷冻干燥后的菌丝放入预先加入液氮的研钵中，充分研磨，再转移到1.5 mL Eppendorf管中，加入0.1 mL 10%的SDS、0.3 mL氯化苄，剧烈振荡使之成乳状；（9）在50℃水浴锅中保温1 h，每隔10 min振荡混合1次；（10）加入0.3 mL 3 mol/L pH 5.2的 NaAc，冰水浴15 min，4℃下12000 r/min离心10 min，取上清液至一个已灭菌的新Eppendorf管中；（11）加入等体积的氯仿‑异戊醇和苯酚，其中氯仿‑异戊醇和苯酚体积各半，振荡摇匀；4℃下12000 r/min离心10 min，取上清至另一个已灭菌的新Eppendorf管中，所述氯仿‑异戊醇的比例为24:1；（12）重复步骤（11），然后加入1/10体积的3 mol/L NaAC和等体积的预冷的异丙醇，轻轻上下混匀，可见有絮状沉淀析出，置入‑20℃冰箱15～17 h，使DNA充分沉淀；（13）4℃下12000 r/min离心10 min，收集沉淀，加入75%预冷的乙醇洗涤沉淀两次；（14）吸除乙醇，在通风橱中干燥10～15 min，加入30～50 μL TE缓冲液溶解DNA，‑20℃保存备用；（15）检测DNA的纯度和浓度；（16）以提取的DNA为模板，PCR扩增真菌的ITS‑rDNA基因；如果PCR扩增出特异性目的条带，将该目的条带胶回收，与T载体连接，转化感受态细胞，随机挑取单克隆进行测序；（17）将所测序列在NCBI上进行Blast序列比对，对烟草内生真菌进行鉴定。