[发明专利]一种分离禽偏肺病毒的方法

摘要

本发明提供一种禽偏肺病毒的分离方法，本发明采用取孵化17～19日龄的SPF鸡胚的气管和肺脏组织混合细胞培养禽偏肺病毒。本发明在常用一个临床发病样本、一次一种敏感细胞分离培养的传统方法基础上，通过同一培养体系、两种混合细胞的分离、传代方法，成功改进AMPV体外培养条件，明显提高了AMPV的分离率，减少了传代次数。

主权项

一种禽偏肺病毒的分离方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：1)样品处理：将采集的临床禽偏肺病毒病发病样品置已灭菌的小烧杯中，用已灭菌的剪刀剪碎，加入灭菌PBS混匀，转移至研磨管中进行振荡研磨；取研磨好的组织混悬液于‑70℃、室温交替冻融两次，然后12000r/min、4℃离心10min，在生物安全柜中取经处理的每份样品上清液2ml，‑70℃冻存备用；2)分离SPF鸡胚气管、肺脏组织：取孵化17～19日龄的SPF鸡胚的气管和肺脏组织，用pH值7.2的PBS溶液洗涤3～4遍，备用；3)洗涤：将洗涤后的气管和肺组织分别均匀剪成1～2mm3大小的组织块，再用pH值7.2的PBS溶液分别洗涤，弃去洗液，备用；4)消化：取步骤3)预剪碎的气管和肺组织置于灭菌的三角瓶中，再分别加入体积比为6～10倍的浓度为0.25％的胰酶‑乙二胺四乙酸二钠溶液混匀，将瓶口用灭菌的塞子盖上，再用灭菌纱布包扎后用线绳包扎紧，在37℃条件下进行消化，消化后室温3000r/min离心15min，弃去消化液，将细胞沉淀用pH值7.2的PBS溶液重悬、均匀振荡洗涤细胞沉淀2次，每次洗涤后以室温、3000r/min离心10min；轻轻洗涤2次，离心后留细胞沉淀备用；5)分装培养：取经过洗涤后的细胞沉淀，在二级生物安全柜中用无菌吸管吸取含10％新生牛血清的DMEM培养基进行充分吹打，以均匀分散细胞，再用无菌纱布过滤细胞悬液去掉未充分消化的较大组织块，室温下3000r/min离心10min，再将细胞沉淀悬浮于含10％新生牛血清的DMEM中，进行细胞计数，根据细胞计数结果，再用含10％新生牛血清的DMEM将两种细胞的密度稀释到2×106个/ml，再将两种细胞悬液等量混合后接入24孔培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中进行培养、观察，直至铺满单层，培养时间为36～48h；6)接种：将步骤1)中‑70℃冻存、已处理好禽偏肺病毒病样品上清进行滤过除菌，接种入步骤5)培养的混合细胞中，接种结束后置于37℃、5％CO2培养箱中进行吸附；吸附结束后弃去接种液，再往各接种孔中加入含2％新生牛血清的DMEM维持液，然后将培养板置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，培养至96h收获全部细胞培养物，此为第一代病毒培养物；7)传代及鉴定取保存的第一代病毒培养物，经室温、‑70℃反复冻融2次，按步骤6)继续进行连续传代培养；连续传5代。