[发明专利]兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法

摘要

本发明属于生物蛋白技术领域，具体涉及兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法。该方法主要包括如下工艺步骤：将兔血中加入抗凝剂，离心收集沉淀；将沉淀用生理盐水冲洗，离心，去除血红蛋白；去离子水等倍体积搅拌溶血；向溶血液中加入等倍体积95%预冷乙醇，0.2倍体积的预冷氯仿；搅拌，离心，取上清；上清加热到60℃，保温15分钟，然后速降至室温，离心，取上清；生理盐水中冷却，加入预冷丙酮，搅拌，取沉淀，用去离子水溶解；脱盐层析；沉淀用HAC-NaAC溶液清洗2次后用PBS溶液重溶，再通过0.45um的滤纸过滤；离子交换层析；超滤；SOD洗脱液在4℃的条件下离心，取上清，即为SOD原液。本发明的方法操作简单，提取的超氧化物歧化酶纯度高。

主权项

兔血中超氧化物歧化酶的纯化制备方法，主要包括如下工艺步骤：（1）、将50L新鲜兔血按16:1的比例加入4.0%的枸橼酸钠或柠檬酸钠，搅匀；（2）、连续流离心机离心，离心力约为400g；离心上清为血浆，沉淀物为血球等细胞，收集沉淀；（3）、将收集的沉淀用4倍生理盐水冲洗，连续流4000转离心，重复三次，去除血红蛋白；然后去离子水等倍体积搅拌溶血；（4）、向溶血液中加入等倍体积95%的预冷乙醇，0.2倍体积的预冷氯仿；搅拌20分钟后静置1小时，然后4000转连续流离心，取上清，紫外分光光度计测定吸光度；（5）、将上清加热到60℃，保温15分钟，然后迅速降温至室温，4000转连续流离心，收集上清，测定吸光度；然后生理盐水中冷却，加入预冷丙酮，搅拌，收集沉淀，然后用去离子水溶解；（6）、上述沉淀用去离子水溶解后，采用G25脱盐柱层析；脱盐层析所得冷沉淀物的主要成分为超氧化物歧化酶；（7）、离心：将冷沉淀的溶液在4℃的条件下，15,000g的离心力，离心约30min，沉淀、上清分开收集；（8）、将沉淀用5mM HAC‑NaAC溶液清洗2次后在用10mM pH为7.0的PBS溶液重溶，将重溶的超氧化物歧化酶通过0.45um的滤纸过滤；（9）、将过滤后溶液经DE32离子交换层析；然后再经超滤；（10）将超滤后的SOD洗脱液在4℃的条件下，15000g的离心力，离心约30min，收集上清，即为SOD原液。