[发明专利]一种镉-低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种镉‑低密度脂蛋白螯合物及其制备方法和应用，该镉‑低密度脂蛋白螯合物是由镉离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白螯合形成。本发明建立了镉‑低密度脂蛋白螯合物的定性定量检测方法，以便定量检测镉‑低密度脂蛋白螯合物在评价一个地区镉污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镉‑低密度脂蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受镉污染的情况，从而间接反映这个地区镉污染程度。本发明建立的镉‑低密度脂蛋白螯合物定量检测方法其准确度大大提高，并且使检测的重复性得到大大提高。

主权项

1.一种镉‑低密度脂蛋白螯合物，其特征在于：其是由镉离子通过锌指结构、巯基、半胱氨酸残基中的至少一种结构与低密度脂蛋白螯合形成；所述的镉‑低密度脂蛋白螯合物通过以下步骤制备：1）镉‑低密度脂蛋白螯合物的合成步骤：在人源低密度脂蛋白中加入镉离子进行螯合反应；2）镉‑低密度脂蛋白螯合物的纯化步骤：采用免疫亲和层析去除步骤1）获得的镉‑低密度脂蛋白螯合物中未参与反应的低密度脂蛋白及镉离子，即得镉‑低密度脂蛋白螯合物；所述步骤2）中包括以下步骤：A．将步骤1）制得的镉‑低密度脂蛋白螯合物复溶于生理盐水中，得到复溶液；B．平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱，将能够与LDL特异性结合的填料装柱后，然后用缓冲液平衡层析柱；C．上样：上样前，用稀释缓冲液稀释复溶液，然后上样，LDL‑Cd螯合物、未与Cd反应的LDL均吸附在填料上，未反应的镉离子随缓冲液流出；D．洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05‑0.1M的Na2HPO4溶液进行洗脱稀释缓冲液；E. 收集：收集洗脱液；收集完毕后立即使蛋白复性；F．将收集到的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水2~4次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本；G．平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗新的层析柱，将能够与镉离子特异性结合的填料装柱后，用稀释缓冲液平衡层析柱；H．上样：上样前，稀释缓冲液稀释样本，然后上样；I．洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5‑1.0M的Na2HPO4溶液进行洗脱稀释缓冲液；J. 收集：收集洗脱液，集完毕后立即使蛋白复性；K．透析：将加入复原液后的洗脱液装入透析袋用ddH2O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集透析袋内的样本，得到纯化的镉‑低密度脂蛋白螯合物；还包括步骤3）：对LDL‑Cd螯合物的鉴定步骤：Ⅰ.制备胶床：选择琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、SDS‑聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质，制备胶床；Ⅱ．加样：取步骤2）制得的镉‑低密度脂蛋白螯合物，加入上样缓冲液并混合均匀，然后加样于样品槽中；Ⅲ．电泳：连接电泳板进行电泳；Ⅳ．复溶检测：在胶床上找出含镉的蛋白条带，将该条带取出并溶解，然后利用ICP‑MS法或AAS法检测液体中是否含有镉以及镉含量。