[发明专利]一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法

摘要

本发明公开了一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法，针对天然釉原蛋白组分团聚性强、难以纯化分离的问题，本发明利用反相液相色谱的色谱制度，经过对少量样品的梯度洗脱和等度洗脱分析，确定目标蛋白的最有效洗脱浓度范围并设计出梯度洗脱和等度洗脱结合的洗脱制度，从粗提釉原蛋白中一步分离纯化出多种釉原蛋白目标组分。本发明具有过程简单，成本低，产品纯度高等特点，可用于大规模纯化制备多种釉原蛋白组分。

主权项

1.一种天然釉原蛋白组分的分离纯化方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质梯度洗脱分析：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，用反相液相色谱系统对釉原蛋白的色谱性质进行梯度洗脱分析，使用任意一个普通梯度洗脱，仅需保证粗提釉原蛋白从色谱柱中完全洗脱的色谱梯度；根据得到的梯度洗脱图谱，确定目标釉原蛋白组分及其相关色谱信息，特别是目标釉原蛋白组分完全洗脱时对应的洗脱液有机相浓度；(2)目标釉原蛋白的反相液相色谱性质等度洗脱分析：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，用反相液相色谱系统对目标釉原蛋白的色谱性质进行等度洗脱分析；使用等度洗脱，目标釉原蛋白组分在步骤(1)色谱图中的完全洗脱时对应的洗脱液有机相浓度确定后，以此有机相浓度为参考数值，对该浓度数值附近的有机相浓度，进行一系列的等度洗脱，得到一系列等度洗脱图谱，比较等度洗脱图谱中洗脱峰的分离程度，根据峰分离程度大小确定目标釉原蛋白的最有效洗脱浓度范围；(3)目标釉原蛋白反相液相色谱分离纯化：将粗提釉原蛋白溶于盐酸胍溶液，根据步骤(2)得到的目标蛋白的最有效洗脱浓度范围，用反相液相色谱系统对目标釉原蛋白的色谱性质进行制备洗脱，洗脱过程中，要延长该最有效洗脱浓度范围对应的时间，进而分离出目标釉原蛋白组分，收集目标釉原蛋白色谱峰对应的洗脱液；其中，步骤(1)中，所述的色谱柱为2.1＊50mm，3.5μm分析短柱，反向色谱的条件为：流动相A相‑B相，所述A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；使用在100分钟流动相B的体积百分比由27％线性上升到47％的线性梯度洗脱；其中，步骤(2)中，所述的色谱柱为2.1＊50mm，3.5μm分析短柱，反向色谱的条件为：流动相A相‑B相，所述A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；流动相B从38％浓度开始，进行一系列的等度洗脱；其中，步骤(3)中，所述的色谱柱为制备柱或半制备柱；流动相A相‑B相，所述A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.1％三氟乙酸乙腈溶液；色谱制度为在0‑30分钟，流动相B的体积百分比由32％线性上升到35％；在30到70分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为65％和35％；在70到105分钟，流动相B的体积百分比由35％线性上升到38％；在105‑110分钟，流动相B的体积百分比线性上升至45％；110‑115分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为55％和45％；115‑116分钟，流动相B的体积百分比线性下降至32％；在116‑130分钟，流动相A和流动相B的体积百分比保持为68％和32％；所述的釉原蛋白为猪釉原蛋白；所述的目标釉原蛋白为P148和TRAP。