[发明专利]DNA文库的构建方法

摘要

本发明属于基因工程及分子生物学领域，具体涉及DNA文库的构建方法。本发明的构建方法步骤为样品的提取、定量、片段化、纯化、片段选择、连接磷酸和接头，文库的固定，3’补缺等。利用本发明的构建方法得到的测序文库纯度高、信息完整，能够高效地捕获目的片段，获得精确的测序结果。

主权项

一种DNA文库的构建方法，其特征在于，包括以下步骤（1）样品DNA提取及定量；（2）DNA片段化、纯化及片段选择：打断DNA，进行纯化回收；所述打断DNA使用Covaris超声波打断仪；所述打断DNA使DNA样品成150‑1000bp的片段；所述纯化回收为先用Qiagen 的MinElute进行纯化，然后使用2.5％的琼脂糖凝胶电泳胶回收或Double SPRI bead方法回收；回收450‑700bp的片段；（3）DNA片段质量评价；（4）DNA片段平端化：补平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；所述与平端化的DNA片段相连采用的连接酶为T4连接酶，（5）接头连接磷酸：接头为DNA双链，带有生物素标签，5’链末端是引物端，3’链末端是平端测序key序列，在接头的一侧有标签，其中平端化的接头5’末端连接磷酸基团；所述连接磷酸使用T4 多聚核苷酸激酶，连接6小时以上，（6）DNA片段连接接头：连接磷酸基团后，接头通过T4连接酶与平端化的DNA片段相连；所述连接磷酸后的接头为接头a:5′GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT3′3′GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5′，（7）小片段去除；所述小片段的去除利用AMPure磁珠，去除多余的接头和其他小片段；（8）DNA文库固定，连有接头的DNA片段通过接头带有的生物素与链霉素抗生物素蛋白磁珠上的链霉亲和素结合，固定在磁珠上；（9）PCR 扩增，得到双链DNA文库；（10）双链DNA文库3’端缺口填补；（11）单链DNA文库分离：解开双链，将未结合生物素标签的单链DNA片段洗脱下来，即为单链DNA文库；DNA 文库质量评价和定量。