[发明专利]防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法及其应用

摘要

本发明公开了防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，包括：步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，步骤二、将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后将F1代植株作为父本与转基因株系杂交得到F2代，从F2代中筛选含有外源报告基因的杂合株系即为所需水稻工程保持系，其中，纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为育性调控基因的突变体株系。本发明还公开了防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用。

主权项

1.一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，包括：步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因ZmAA1与育性调控基因能够紧密连锁遗传，所述育性调控基因为水稻EAT1基因；其中，获得含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系的具体方法包括：1.1 分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20 bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物上游序列：5’–GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’下游序列：5’–AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’；1.2 利用CRISPR/Cas9系统将步骤1.1中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；1.3 将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1均构建到植物表达载体上得到重组表达载体；1.4 将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；以及，步骤二、取步骤一中得到的转基因株系作为母本，将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后F1代植株作为父本与作为母本的转基因株系杂交得到F2代，从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，所述纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因的突变体株系；从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系的具体方法包括：针对育性调控基因设计一对能够扩增出包含育性调控基因突变位点在内的PCR产物的检测引物，利用该对检测引物，以表达外源报告基因的转基因植株基因组作为模板进行扩增，若检测到育性调控基因位点为杂合型，则判定该植株为所述水稻工程保持系植株。