[发明专利]一种用于废水中生物降解的二元复合菌群构建方法

摘要

一种用于废水中生物降解的二元复合菌群构建方法，其特点是，包括苯酚和苯胺两种构建方法，均含有：选择菌株、菌株活化、菌株驯化、菌株保存、菌落形态观察、菌悬液制备、不同菌株初始配比的混合菌悬液的制备和二元复合菌群最佳配比选择，在两株具有不同菌落特征，对同一种有机污染物具有降解能力的菌株的基础上，将菌体以不同比例接种于含有目标有机污染物的废水中，在指定的反应条件下，经过指定的生化反应时间后，测定不同接种比例下菌株对目标污染物的降解情况，同时对反应终点时刻培养液中两种菌的菌落形成单位进行计量，最终通过污染物降解效率及两株菌的相对菌落形成单位的计算结果确定用于目标污染物生物降解的二元复合菌群的配比。

主权项

1.一种用于废水中苯胺生物降解的二元复合菌群的构建方法，其特征在于：它包括以下内容：1)选择菌株：选择恶臭假单胞菌和乙酸钙不动杆菌，恶臭假单胞菌和乙酸钙不动杆菌均来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，恶臭假单胞菌的菌株编号为CGMCC No.1.1003，乙酸钙不动杆菌的菌株编号为CGMCC No.1.3615，将恶臭假单胞菌的菌株简称为BA1、乙酸钙不动杆菌的菌株简称为BA2；2)菌株的活化：从营养肉汁琼脂斜面上挑取BA1和BA2的菌苔分别接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养24h进行菌株的活化；3)菌株的驯化：取活化后的BA1和BA2培养液各10mL，分别接种于含有苯胺的驯化培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养，进行菌株的驯化，培养36h后再重复上述过程进行第二个周期的驯化，共驯化5个周期，180h，前两个驯化周期加入1.5mL经过滤除菌的质量体积比为10％的苯胺溶液，第三个周期加入3.0mL经过滤除菌的质量体积比为10％的苯胺溶液，最后两个驯化周期加入8mL经过滤除菌的质量体积比为10％的苯胺溶液；4)菌株的保存：将驯化后的菌株采用倍比稀释法在平板上得到单菌落后，挑取单菌落接种到斜面培养基上，待菌苔长出后放入4℃冰箱中低温保存备用；5)菌落形态观察：采用平板划线的方法将菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基中，置于30℃生化培养箱中培养24h后，观察其菌落形态，主要通过菌落的颜色、透明度、表面光滑性和边缘形态对用于苯胺生物降解的二元复合菌群构建的BA1和BA2菌株进行区分；6)菌悬液制备：将驯化后的BA1和BA2分别接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于30℃，150rpm摇床中振荡培养24h，将培养液置于台式高速冷冻离心机中以10000rpm离心5min后，弃去上清液后用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液重悬，再次离心后弃去上清液，如此操作两次清洗菌体，再用0.1mol/L,pH8.0的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液重悬，分别制成OD600＝1.2的菌悬液置于冰箱中冷藏备用，同时通过平板计数法分别测定菌悬液中BA1和BA2的活菌数；7)不同BA1、BA2初始配比的混合菌悬液的制备：根据菌悬液中测定的BA1和BA2活菌数，吸取BA1和BA2的菌悬液，使混合后的BA1、BA2菌悬液的总活菌量为2×108CFU/mL，并使BA1和BA2活菌初始比例分别为0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0，其中10/0代表体系中仅有BA1，0/10代表体系中仅有BA2；8)二元复合菌群最佳配比的选择：将BA1和BA2活菌初始比例为0/10、1/9、2/8、3/7、4/6、5/5、6/4、7/3、8/2、9/1和10/0的混合菌悬液分别以体积体积比为10％的量分别接种于含苯胺300mg/L的无机盐培养液中，于30℃，150rpm摇床中振荡培养36h后测定残留的苯胺和TOC浓度，同时通过倍比稀释法依据菌落形态特征对生物降解反应结束后体系中BA1和BA2的数量进行计量；定义CFU_BA1为BA1在10/0体系中的活菌数，即仅接种BA1的体系，CFU_BA2为BA2在0/10体系中的活菌数，即仅接种BA2的体系，CFU_BA1·BA2为BA1在BA2存在时的活菌数，CFU_BA2·BA1为BA2在BA1存在时的活菌数，BA1的相对活菌数BA2的相对活菌数当RCFU＜1时，代表一株菌生长和繁殖受到了另一株菌的抑制，而当RCFU＞1时，代表另一株菌的存在对该菌株的生长和繁殖起到了促进作用；根据两株菌在不同初始活菌比例下的苯胺降解率、TOC降解率以及RCFU计算结果，选择苯胺降解率、TOC降解率最高且RCFU_BA1和RCFU_BA2计算结果均大于1的初始活菌比例作为苯胺生物降解二元复合菌群的构建比例，此时二元复合菌群对苯胺的降解效果最佳且形成了互利共生的关系。