[发明专利]透明质酸修饰单壁碳纳米管制备诊断治疗的还原敏感性药物纳米剂的方法及应用

摘要

本发明涉及透明质酸修饰单壁碳纳米管制备诊断治疗的还原敏感性药物纳米剂的方法及应用，可有效解决抗癌药物阿霉素的肿瘤靶向性差、毒副作用大和靶向性差、弛豫效能低、半衰期短的问题，该传递体系由透明质酸修饰后的单壁碳纳米管通过3，3’‑二硫代二丙酸作为连接臂和阿霉素相连，然后将三氯化钆吸附到单壁碳纳米管上，再用表面活性剂分散形成用透明质酸修饰的单壁碳纳米管，用于诊断治疗的还原敏感性药物的纳米制剂，本发明具备生物相容性好、肿瘤靶向性好、热疗与化疗相结合、诊断与治疗为一体的优点，是诊断和治疗肿瘤药物上的创新，经济和社会效益巨大。

主权项

一种透明质酸修饰单壁碳纳米管制备诊断治疗的还原敏感性药物纳米剂的方法，其特征在于，由透明质酸修饰后的单壁碳纳米管通过3，3’‑二硫代二丙酸作为连接臂和阿霉素相连，然后将三氯化钆吸附到单壁碳纳米管上，再用表面活性剂分散形成用透明质酸修饰的单壁碳纳米管，用于诊断治疗的还原敏感性药物的纳米制剂；所述透明质酸为分子量大于等于600道尔顿且小于等于400 kd的低分子量透明质酸；所述单壁碳纳米管的长度为1～3μm、直径为1～2nm；所述连接臂为碳原子数2～12的3,3’‑二硫代二丙酸或辛二酸；所述3,3’‑二硫代二丙酸中的二硫键具有还原敏感性，在肿瘤细胞高浓度的谷胱甘肽作用下迅速断裂释放药物，由以下步骤实现：（1）羧化碳管与氨化透明质酸连接：称取25～75mg羧化碳管于15～45ml反应溶剂的烧杯中，冰浴探超15～45min，成羧化碳管溶液；称取氨化透明质酸60～120mg溶于5‑15ml的溶剂中，成氨化透明质酸溶液；称取EDC 120～240mg、NHS 80～160mg，用1～7ml溶剂涡旋溶解，加入到羧化碳管溶液中，搅拌室温反应5～25min，成羧化碳管混合溶液；在氨化透明质酸溶液中加入三乙胺100～260μl，然后将氨化透明质酸和三乙胺的混合溶液快速滴加至羧化碳管混合溶液中，室温反应8～40h，加入3～4倍体积预冷的丙酮，冷却析晶，过滤，丙酮洗涤沉淀，得沉淀物，沉淀物用水复溶，透析2d，冻干；所述的溶剂为水、甲酰胺、或N,N‑二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N,N‑二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂；所述的氨化透明质酸是，将透明质酸95‑105mg、1‑ 乙基‑(3‑ 二甲基氨基丙基) 碳二亚胺盐酸盐254‑264mg 和N‑ 羟基琥珀酰亚胺150‑160mg，溶解在8‑12ml 的有机溶剂中，室温搅拌30 min，得反应液，将反应液缓慢滴入0.4‑0.6ml 乙二胺的甲酰胺溶液中，冰浴滴加1h，升至室温反应6‑48h，加入50ml 丙酮沉淀，抽滤，得沉淀物，沉淀物加水复溶，透析2d，冷冻干燥，即得氨化透明质酸，有机溶剂为甲酰胺、N,N‑ 二甲基甲酰胺、二甲基亚砜的一种；（2）制备SWCNTs‑HA‑ss‑COOH：取500～1500mg碳原子数2～12的3,3’‑二硫代二丙酸或辛二酸为连接臂，溶解于反应溶剂中，EDC 500～1500mg、NHS 200～1000mg分别涡旋溶解于反应溶剂中，将上述溶液混合搅拌活化5～25min，成活化溶液；将HA‑SWCNTs 50～350mg超声溶解，与活化溶液混合，室温条件下搅拌1～8h，所得产物通过丙酮冰浴析晶，过滤，收集沉淀，沉淀用水复溶，透析2d，除去多余的3,3'‑二硫代二丙酸、EDC、NHS盐，冻干，成SWCNTs‑HA‑ss‑COOH，4℃保存；所述的反应溶剂为水、或甲酰胺、或N,N‑二甲基甲酰胺与水、或甲酰胺与水、或N,N‑二甲基甲酰胺与甲酰胺的混合溶剂；（3）SWCNTs‑HA‑ss‑COOH与DOX连接成SWCNTs‑HA‑ss‑DOX：取1～8mg DOX•HCL溶解于500～1500μl的pH为7～10的PBS溶液中，成第一溶液；称取2～15mg的SWCNTs‑HA‑ss‑COOH超声溶解于200～800μl反应溶剂，成第二溶液，将两种溶液混合在一起反应1～4h，成混合液；取10～60mg盐酸羟胺溶解于200～2000μl的pH为7～10的PBS溶液中，加入混合液中反应0.5～5h，得产物，产物用超纯水透析2d后，冻干，成SWCNTs‑HA‑ss‑DOX；所述的反应溶剂为二氯亚砜、或N,N‑二甲基甲酰胺、或二氯亚砜与N,N‑二甲基甲酰胺的混合溶剂；（4）Gd的负载：5～10mg的SWCNTs‑HA‑ss‑DOX加入到水中，在冰浴中超声5～60min分散，离心弃去未分散的沉淀，成单壁碳纳米管混悬液；室温磁力搅拌条件下将50～80mg的GdCl3粉末溶于水中，滴加到分散均匀的单壁碳纳米管混悬液中，产生絮状沉淀，即成Gd/SWCNTs‑HA‑ss‑DOX；（5）制备Gd/SWCNTs‑HA‑ss‑DOX药物纳米剂：将步骤（4）含有絮状沉淀的混合物离心2～30min，弃去上清液得沉淀，在沉淀中加入表面活性剂溶液，冰浴超声5～55min分散，然后离心2～25min，弃去沉淀，上清液透析10‑16h，再离心2～30min，弃去沉淀，即得透明质酸修饰单壁碳纳米管制备诊断治疗的还原敏感性药物纳米剂；所述的表面活性剂为大豆卵磷脂，或大豆卵磷脂与泊洛沙姆的混合物，表面活性剂溶液是由每10mg的表面活性剂加入1ml的水制成。