[发明专利]一种以FMYYSSR-5标记对烟草原料进行鉴定的方法

摘要

本发明公开了一种应用FMYYSSR-5分子标记技术鉴定烟草原料的方法，属于分子生物学研究领域。本发明在经过烟草基因数据信息筛选后，确定以FMYYSSR-5标记，对样品是否为烟草进行鉴定。在以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，对各个样品的DNA进行提取后，以本发明所设计的引物对其进行PCR扩增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置，视待测样品在相应位置有无扩增条带产生来判断该样品是否为烟草。由于本方法以烟草物种DNA的特异性作为鉴定依据，因此与传统鉴定方法相比，有更加客观、更加准确、更加可靠的优点。

主权项

一种以FMYYSSR‑5标记对烟草原料进行鉴定的方法，其特征在于：在以十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法，对各个品种标准烟草样品的DNA进行提取后，以所设计的引物对其进行PCR扩增，在经过电泳分析后，确定烟草物种的特异性条带位置；再以同样的方法对样品进行处理后，视其在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草，具体步骤如下：1）FMYYSSR‑5标记的引物设计，上下游引物序列分别为TCTGATTGTCTTCTTCTTTAATGGG和TTGTTTCCAGAATCCATTTGC；2）烟草样品及待测样品DNA提取；(1) 取不同样品分别将其组织碾磨成细粉末，放入2 mL离心管中；(2) 加入600~800 μL的CTAB提取缓冲液，混匀，在CTAB在65℃水浴预热，每3~5 min轻轻震荡几次，20 min后12000 r/min离心10~15 min；(3) 小心吸取上清液，加入等体积的苯酚：氯仿溶液各400 μL，混匀，4 ℃，12000 r/min，离心10~15 min；(4) 小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4 ℃，12000 r/min，离心10~15 min，重复2~3次，以蛋白层不出现为止；(5) 取上清，‑20 ℃沉淀1~2 h，4 ℃，12000 r/min，离心10~15 min；(6) 弃去上清液，用50%~70%乙醇洗涤沉淀2次；室温下干燥10~15 min后，于‑20 ℃或者‑70 ℃下保存备用；3）PCR反应按以下程序进行：解链温度95℃，30秒，退火温度55℃，30秒，延伸温度68℃，30秒，重复35个循环；4）取25 μL的PCR产物凝胶电泳分析，在确定烟草物种的特异性条带位置后，视样品在相应位置有无条带产生来判断该样品是否为烟草。