[发明专利]一种农杆菌介导的甜高粱遗传转化方法

摘要

本发明为“一种农杆菌介导的甜高粱和籽实高粱的遗传转化方法”，属植物基因工程技术领域。本发明对甜高粱品种Keller以及籽实高粱品种JR105为实验材料，选择幼穗诱导的愈伤组织或者幼胚为外植体，采用农杆菌介导法转化外源基因，通过外植体选择，农杆菌侵染，共培养，筛选培养，分化培养以及生根培养等过程，得到转化植株。经检测表明，外源基因在不同的基因型中得到了不同程度的表达，说明本发明的再生体系可用于遗传转化。Keller遗传转化效率在3～7％之间，JR105的转化效率在7～16％之间。本发明为利用生物技术手段改良高粱的品质以及提高抗逆性等研究提供了技术支持，同时也为高粱功能基因的验证打下良好的基础。

主权项

1.一种农杆菌介导的甜高粱遗传转化方法，包括如下顺序步骤：1)选取长约1.5～5cm幼穗，其旗叶5～10cm，旗下一叶18‑20cm；所述幼穗切成3段；2)将幼穗置于诱导愈伤培养基中培养，所述诱导愈伤培养基CIM：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L+MES 500mg/L+PVP 5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4‑D 2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+琼脂8g/L，高压灭菌前pH 6.0；3)将幼穗诱导产生的胚性愈伤组织用农杆菌介导法将外源基因导入，所述农杆菌侵染培养基为IM：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+MES 600mg/L+2,4‑D 2mg/L+PVP40 5g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+AS 200μmol/L，pH 5.2；4)外植体置于共培养基中共培养，所述共培养基COM：MS基础培养基4.43g/L+MES 600mg/L+半胱氨酸0.3g/L+CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L+2,4‑D 2mg/L+PVP40 5g/L+抗坏血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+蔗糖20g/L+葡萄糖10g/L+琼脂8g/L+AS 200μmol/L，高压灭菌前pH 5.6；5)再转入筛选培养基上进行梯度筛选培养，所述筛选培养基为：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+脯氨酸1.4g/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺1g/L+CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L+MES 500mg/L+PVP 5g/L+抗坏血酸10mg/L+2,4‑D 2mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧苄青霉素200mg/L+草丁膦3～5mg/L+琼脂8g/L，高压灭菌前pH 6.0，其中草丁膦的浓度为3mg/L和5mg/L梯度筛选；6)将存活的抗性愈伤组织转接于分化培养基中培养至出苗，所述分化培养基为：MS基础培养基4.43g/L+水解酪蛋白500mg/L+半胱氨酸0.3g/L+天门冬酰胺0.15g/L+CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L+MES 500mg/L+PVP 1g/L+抗坏血酸10mg/L+6‑BA 1mg/L+IAA 1mg/L+山梨醇10g/L+蔗糖30g/L+羧苄青霉素100mg/L+草丁膦3mg/L+琼脂8g/L，高压灭菌前pH 6.0；7)将苗移入生根培养基中培养出根，所述生根培养基为：MS培养基+水解酪蛋白250mg/L+MES 250mg/L+IBA 1.5mg/L+PVP 1g/L+抗坏血酸10mg/L+蔗糖15g/L+羧苄青霉素50～80mg/L+草丁膦3mg/L+琼脂5g/L，高压灭菌前pH 6.0；8)转移至营养土：蛭石＝2:1配成的土壤中培养1～2周后移栽至温室花盆或大田；所述甜高粱为品种Mn‑3025或Keller。