[发明专利]一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法

摘要

一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂，2）细胞培养，3）细胞染毒，4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，5）结果与分析。本发明相比现有技术具有以下特点：在整个试验过程中减少了多次洗涤细胞的试验步骤，使操作方法更简便；针对间接标记法中较强的非特异荧光干扰的问题，确立了直接免疫荧光标记的方法，使检测过程更快速方便，检测结果也更稳定；本发明省去了间接标记法中标记第一抗体和第二抗体的步骤，缩短了检测周期，提高了检测效率；本发明用流式细胞仪检测γH2AX的相对荧光强度，结果更客观、准确，统计学精度高。

主权项

一种基于γH2AX的细胞DNA损伤检测方法，其特征在于：包括以下工艺步骤：1）配制实验试剂：（1）细胞培养液；（2）预冷的70%乙醇；（3）磷酸缓冲盐溶液（PBS）；（4）0.5%的TritonX‑100；2）细胞培养：CHO细胞生长于含有10%胎牛血清的DMEM 培养液中，放置于37 ℃、5％CO₂细胞培养箱中培养；3）细胞染毒：将指数生长期的CHO细胞，按1×10⁶个/孔的细胞密度接种于6孔板中，培养24 h后，进行细胞染毒，每个处理组设三个平行，染毒时间为24 h；4）基于流式细胞仪对细胞中γH2AX测定，具体步骤如下：a、细胞提取：细胞染毒24 h后弃去染毒液，加入500 μL0.25%胰酶，消化1‑2 min，弃去胰酶，加入1 mL磷酸盐缓冲溶液（PBS）混悬，1500 rpm/min离心，弃去上清，洗涤两次；b、乙醇固定：准备70%的乙醇，‑20℃预冷，在涡旋使细胞团粒松开后，边涡旋边一滴滴的加入预冷的70%乙醇1 mL，放置于‑20℃冰箱固定过夜；c、TritonX‑100破膜：取出固定的待检测样品，1500 rpm/min离心，弃上清，用PBS洗涤两次，加入0.5%的TritonX‑100 100μL破膜；d、加入FITC直标的Anti‑H2AX 10 μL至待检测样品，室温孵育50 min后转移到流式管中待检测；e、流式细胞仪检测；5）结果与分析：通过流式细胞仪检测含有γH2AX焦点的细胞数和细胞总数，并依下述公式，计算检测的细胞中产生γH2AX的焦点率：。