[发明专利]一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法

摘要

一种聚乙烯亚胺金属配位固定化的多酶体系及其制备方法，属于固定化酶技术领域，利用聚乙烯亚胺与金属离子配位固定甘油脱氢酶、辅酶氧化酶，以及甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶，在固定化过程中聚乙烯亚胺分子通过亚胺与金属离子的配位作用，形成网状的聚乙烯亚胺骨架，配位在聚乙烯亚胺上的金属离子与甘油脱氢酶、辅酶氧化酶的C端组氨酸标签，以及甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶的C端组氨酸标签形成配位键，获得固定化多酶体系。金属离子在固定化过程中起配位交联作用，并可提高多酶体系的催化效率。本发明的优点在于多酶耦联效率高、制备条件温和、工艺简单易行。所得固定化酶具有固定化率高，活性回收率高，能够明显提高温度稳定性、重复使用稳定性好等优点。

主权项

1.一种聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)工程菌的构建：构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因，并利用上述两基因构建带有组氨酸标签的甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶基因，所述带有组氨酸标签的甘油脱氢酶基因、带有组氨酸标签的辅酶氧化酶基因、带有组氨酸标签的甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；用BamHⅠ和xholⅠ分别双酶切上述基因及pET32a质粒，用T4DNA连接酶连接转化大肠杆菌(DH5α)，然后提取质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)制备可表达甘油脱氢酶、可表达辅酶氧化酶、可表达甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶的工程菌；2)粗酶液制备：将步骤1)得到的工程菌接种到含有氨苄青霉素的LB培养基中，培养一段时间后加入诱导剂IPTG；培养所得发酵液离心获得细胞，配制成细胞液；超声破碎，将破碎液离心，收集上清液即为粗酶液；3)纯酶的制备：采用镍柱对步骤2)得到的粗酶液进行纯化并利用pH 6.5～8.0的Tris‑HCl缓冲液超滤除盐，得到甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶；4)聚乙烯亚胺‑金属溶液制备：配置浓度为5～200mg/ml的聚乙烯亚胺溶液，所述聚乙烯亚胺是分子量范围为20～500kDa的直链聚乙烯亚胺；向该溶液中加入金属盐溶液并使其终浓度为0.05～50mmol/L，配成混合溶液，4℃保温0.5～4h，离心除去上清，沉淀重悬于1～100mmol/L的pH 6.0～8.0的磷酸缓冲液或1～100mmol/L的pH 8.0～10的氨水‑氯化铵缓冲液中，得到聚乙烯亚胺‑金属溶液；5)固定化多酶体系制备：将含有步骤3)中得到的甘油脱氢酶、辅酶氧化酶、甘油脱氢酶‑辅酶氧化酶融合酶的酶浓度为0.05mg/ml～10mg/ml的酶溶液以1～4:1的比例加入至步骤4)中得到的聚乙烯亚胺‑金属溶液，形成固定化颗粒，离心分离，冲洗，重悬于0.05M的pH7.0的Tris‑HCl缓冲液或0.05～0.1M的pH8.0～10.0的氨水‑氯化铵缓冲液中，即得聚乙烯亚胺金属配位固定化多酶体系。