[发明专利]酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法

摘要

本发明公开了一种酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，通过单因素试验和响应面优化试验，确定了碱性蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解制备扁杏杏仁抗氧化肽的最佳工艺条件：酶用量6725U/g、底物浓度3％、酶解温度60℃、pH8.28，经3次平行试验验证，得到的酶解液对OH的清除率的平均值为84.18％，DH的平均值为20.87％，还原力的平均值为0.743，并采用透析袋、凝胶色谱技术、高效液相色谱HPLC、半制备液相RP-HPLC对AAMH进行进一步分离纯化，并采用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪技术和Edman降解法对分离纯化得到的扁杏杏仁抗氧化肽的结构进行了鉴定。

主权项

酶解扁杏杏仁制备扁杏杏仁抗氧化肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、取扁杏杏仁500g，于45℃恒温水浴锅中浸泡2h，手工去皮，置于50℃的干燥箱中烘干，粉碎并过80目筛制得扁杏杏仁粕；S2、将所得的扁杏杏仁粕和石油醚在30‑60℃下，以1∶5(W/V)的比例混合，在室温下不断搅拌脱脂5h，真空抽滤，回收石油醚，以上工艺重复3次后，将所得扁杏杏仁粕置于通风厨中挥发有机溶剂48h，得脱脂扁杏杏仁粕，在4℃下保存；S3、取脱脂扁杏杏仁粕若干，用蒸馏水配置成浓度为2‑4％的溶液，置于50℃的恒温震荡水浴锅中，预热30min，调节PH至7.5‑8.5，按5000‑10000U/g的比例加入碱性蛋白酶‑风味蛋白酶复合酶，碱性蛋白酶∶风味蛋白酶的酶活比为3∶2，55‑65℃下，酶解2.5h后，将酶解液于90℃的水浴锅灭酶15min，终止反应，待冷却至室温后，以4000r/min离心20min，取上清液冷冻干燥即得扁杏杏仁酶解液；S5、向经处理后一端封好的透析袋中加入2/3的扁杏杏仁肽酶解液，将另一端封好，置于盛有500mL双蒸水的烧杯中，用磁力搅拌器不断搅拌，每隔4h换水一次，直到透出液不再有颜色变化，将透出液在50℃的旋转蒸发仪浓缩，将浓缩液冷冻干燥24h，得到了分子量大于3500Da的组分A和分子量小于3500Da的组分B；S6、将经过处理后的葡聚糖凝胶Sephadex G‑25装柱；称取透析袋截留量小于3500Da的组分B的冻干粉若干，溶于双蒸水中，配成50mg/mL的溶液，取2mL溶液上柱，选用超纯水作为洗脱液，并用蒸馏水以0.3mL/min的流速洗脱；将洗脱组分分管收集，每5min收集一管；重复上样，合并每次分离时相同位置的组分峰，将所收集的组分峰冷冻干燥，得组分B1、组分B2、组分B3和组分B4；S7、将所得4个组分进行抗氧化活性测定，并将具有较强抗氧化活性的组分B4配制成浓度为40mg/mL，用葡聚糖凝胶Sephadex G‑15继续进行进一步分离纯化，按出峰先后顺序分别记作组分B4a和组分B4b，分别重复收集同一时间的各组分，并进行冷冻干燥；S8、将组分B4b经RP‑HPLC Agilent 1260分离后，收集得到10个主要组分，分别记作B4b‑1，B4b‑2，B4b‑3，B4b‑4，B4b‑5，B4b‑6，B4b‑7，B4b‑8，B4b‑9，B4b‑10，重复进样，多次收集各组分，并分别将其冷冻干燥；S9、通过测定各组分的DPPH清除率，筛选出抗氧化活性较强的两个组分B4b‑4和B4b‑6；采用MALDI‑TOF‑MS质谱分析法测得抗氧化活性肽B4b‑4和B4b‑6的分子量为674.1Da和567.9Da；采用Edman降解法对组分B4b‑4和B4b‑6的N‑端氨基酸序列进行测定，得到组分B4b‑4的氨基酸序列为Val‑Leu‑Tyr‑Ilt‑Trp；组分B4b‑6的氨基酸序列为Ser‑Val‑Pro‑Tyr‑Glu。