[发明专利]穗花杉双黄酮在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法

摘要

本发明公开了一种穗花杉双黄酮(AME)在制备骨组织工程种子细胞中的试验方法，首先对骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)进行培养，分别加入成骨诱导液(OIM)或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，然后采用MTT法检测细胞的增殖；细胞完全融合后加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液进行培养，再加入细胞裂解液，采用试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Bio‑Rad法测定蛋白浓度；对细胞进行碱性磷酸酶染色，并在显微镜下观察拍照；细胞完全融合后，每孔分别加入成骨诱导液或含不同浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，采用骨钙素检测试剂盒进行骨钙素水平测定。

主权项

1.穗花杉双黄酮促进骨髓基质干细胞(MSCs)增殖及其成骨分化的用途，其特征在于，所述用途通过以下试验步骤实现：(1)MSCs细胞培养将MSCs置于含8～12％胎牛血清的α‑MEM培养液，37℃、5％CO2孵箱内培养，每2～3d换液1次，细胞达80％融合时，0.25％胰蛋白酶消化传代培养；(2)细胞增殖检测MSCs细胞接种于96孔培养板，细胞增殖检测采用MTT法；空白组和浓度分别为0.1、1、5、10、50μmol·L‑1穗花杉双黄酮组分别处理后，加入MTT使其终浓度为0.45～0.55mg/mL，37℃培养箱内孵育4～5h，弃培养液，加入140～160μL DMSO使甲瓒颗粒完全溶解，酶标仪波长570nm测定吸光度值，结果表明5μmol·L‑1‑50μmol·L‑1穗花杉双黄酮可促进MSCs增殖；(3)碱性磷酸酶(ALP)活性测定细胞完全融合后，每孔分别加入含0、0.1、1、5、10μmol·L‑1浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，所述成骨诱导液由内含0.01mmol·L‑1地塞米松、50μmol·L‑1维生素C和10mmol·L‑1β‑磷酸甘油α‑MEM完全培养基组成；隔天换液，6～8d后吸出各孔培养液，各孔加入45～55μL细胞裂解液，采用试剂盒检测碱性磷酸酶活性，Bio‑Rad法测定蛋白浓度，结果显示0.1、1、5、10μmol·L‑1浓度穗花杉双黄酮浓度依赖性地增强MSCs成骨分化中的ALP活性；(4)碱性磷酸酶染色PBS洗涤细胞表面两次，小心吸去PBS；每孔加入70％乙醇固定细胞8～12min，小心吸去乙醇，加入碱性磷酸酶缓冲液480～520μl平衡5min，重复两次；小心吸去碱性磷酸酶缓冲液，每孔加入280～320μLNBT/BCIP染色液，37℃下暗室里孵育25～35min；小心吸去染色液；加入0.8～1.2ml蒸馏水终止反应；显微镜下观察，拍照；(5)骨钙素测定细胞完全融合后，每孔分别加入含0、1、5、10μmol·L‑1浓度穗花杉双黄酮的成骨诱导液，每3天更换一次培养液，12天后收集上清液，采用骨钙素检测试剂盒进行骨钙素水平测定，结果显示1、5、10μmol·L‑1浓度穗花杉双黄酮提高了MSCs成骨分化中骨钙素分泌。