[发明专利]一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法

摘要

本发明公开了一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，属于发酵工程技术领域。利用磷酸盐浸提、硫酸铵分步离心沉淀、透析、聚乙二醇（PEG）浓缩、低温电泳和质谱等技术相结合的方法分离、纯化和鉴定了微生物产耐盐蛋白酶。与常规方法相比，利用本方法分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶具有“可视化”、快速、条件温和、不需添置特殊电泳、离子交换和凝胶色谱设备等优势。

主权项

1.一种快速分离、纯化和鉴定微生物产耐盐蛋白酶的方法，其特征在于按照下述步骤进行：（1）微生物培养及耐盐蛋白酶样品制备：依据微生物的最适培养基、培养条件进行培养，至蛋白酶酶活达到最高时取样、进行高盐发酵制备耐盐蛋白酶样品，发酵条件为种曲与质量浓度为20‑30%盐水按重量比1:1混合、密封，25‑60 ℃发酵15‑180 d；（2）耐盐蛋白酶及其对照即新鲜种曲粗酶液的提取：按照磷酸盐缓冲液与对照即新鲜种曲的重量比为1:2，与上述盐水发酵醪重量比例为1:1，分别充分混合，40 ℃浸提1 h；（3）硫酸铵法分步沉淀粗蛋白酶：定性滤纸分别过滤步骤（2）所得粗酶液，添加硫酸铵至10‑30%饱和浓度，4 ℃条件下，转速为5000‑10000 g离心5‑30 min、去除沉淀，上清液中继续添加硫酸铵至50‑100%饱和浓度，4 ℃条件下转速为10000‑20000 g离心5‑30 min、去上清，收集沉淀即为粗蛋白酶；（4）粗酶液透析除盐和小分子杂质：5‑10 mL蒸馏水溶解沉淀，移入透析袋，pH为7.2的0.01 M磷酸盐缓冲液中透析24 h，其中冰浴并换缓冲液3‑4次；（5）透析液浓缩：将PEG10000研磨成粉末状，覆盖在透析袋上浓缩至透析液约1 ml；（6）样品和对照蛋白酶的电泳分离：电泳条件为浓缩胶和分离胶丙烯酰胺浓度分别为5%和7.5‑12.5%，两种胶中十二烷基磺酸钠SDS浓度为0.1%；常规电泳槽加pH为8.8的电泳缓冲液置于冰盒中预冷30 min；加上述粗酶液15 μL进行电泳分离，分离电压50‑100 V；电泳结束后胶条在2.5%聚乙二醇辛基苯基醚TritonX‑100水溶液中洗涤3次，每次30 min，以去除SDS残留；（7）分离胶即条带上的蛋白酶与底物胶即含大豆分离蛋白的酶解反应；将上述（6）处理过的胶条与底物胶“面对面”放置，底物胶中丙烯酰胺浓度7.5%并且不含SDS，含1%大豆分离蛋白；表面覆盖一层pH7.2的0.1 M磷酸盐缓冲液浸润的定性滤纸保湿，20‑60 ℃反应1‑10 h；（8）耐盐和非耐盐蛋白酶的“可视化”鉴定；反应结束后考马斯亮蓝R‑250染色、脱色液脱色；脱色液为甲醇:乙酸:水=10:10:80；对比样品和对照电泳图谱和相应的底物胶透明条带，找出耐盐和非耐盐蛋白酶条带；（9）耐盐蛋白酶和非耐盐蛋白酶的质谱鉴定；将目标蛋白酶条带挖点，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱MALDI‑TOF/TOF‑MS鉴定，得出耐盐蛋白酶的种类、来源和氨基酸序列生物学信息；步骤（1）所述微生物为米曲霉；步骤（2）所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，缓冲液的离子浓度为0.01‑0.5 M、pH为2.5‑8；步骤（4）所述透析袋截留分子量范围为1000‑20000 Da。